Question

western blot 杂带及背景脏问题。

目的蛋白（红箭头）26kd。加样5ul，电泳80v30min；100v1h。转膜100v90min，0.45umhatf膜。碧云天封闭液1h，多克隆一抗4度过夜，二抗（荧光）1h，上机。
目的蛋白和内参是分开孵育的。目的蛋白杂带很多，且背景脏有杂点。请教一下大神们什么原因？

Answer 1

先说这个实验总体的背景，有黑点，这种背景非常像封闭液没有完全溶解带有杂质，或者是容器没洗干净，有脏东西了，最好把封闭液用0.22um的膜过滤一下再做。然后其他器皿都洗刷干净。洗液里面加点tween试试。
再一个看条带，感觉特异性不太好，条带太多了。看过抗体厂家提供的图也是这样的吗？可以先试试把抗体浓度降低，孵育时间缩短，减少非特异结合。但是从你的情况看，估计很容易导致特异蛋白没信号，不过还是值得一试的。
内参看的话，抗体特异性好很多呢。所以可能抗体的问题会比较大。这个抗体别人用怎么样啊？