Question

质粒中导入的片段无法酶切取出

背景：要在质粒中导入一个片段，为检测该片段是否已经导入到质粒中，分别进行了三次试验。
1，将导入过的大肠杆菌菌落直接进行菌落pcr 电泳发现有片段大小的条带。
2，将质粒从转化大肠杆菌中提取出来 用同样的引物进行pcr, 电泳之后也能有该大小的条带
3.，将质粒取出后进行双酶切，再跑电泳，没有发现原片段大小的条带。
目前有几个事实可以确定，1,2步的实验没有出现差错，是可信的，所有的试剂使用均是正确的，理论上导入的片段也是可以通过双酶切取出的。

但为什么第三个试验没有取出片段呢？？？？

Answer 1

第一，没有切开，设单酶切对照，确保两个酶都能起作用
第二，质粒质量不好，导致切不开，可以试剂盒纯化
第三，质粒量要控制好，不能太多，太多切不开；也不能太少，太少切开了也看不到
第四，PCR存在假阳性、假阴性的可能。

Answer 2

可能原因：
1。2个酶中1-2个酶失活。
2。插入位置错误（如果你PCR引物的位置在片断内部的话）。

Answer 3

pcr 很灵敏，很少的量就可以鉴定出来，质粒却需要的量比较大。