Question

PCR反应温度怎么设置？

Answer 1

在pcr反应过程中，要使用三个不同的温度变化，有变性，退火，扩增三个不同的反应阶段，而这三个反应需要的最适温度不同。具体设置如下：

1、变性反应温度的设置

当温度控制在90 °C以上时DNA会发生变性，双链DNA解链成单链。

2、退火反应温度的设置

当温度下降到50 °C的时候，DNA复性，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。

3、扩增反应温度的设置

当温度上升到72 °C左右时延伸，DNA 聚合酶在此时有最大活性，能够催化4 种脱氧核苷酸合成新的DNA链。

扩展资料：

PCR温度与时间的设置：

基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。

对于较短靶基因（长度为100～300bp时）可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸（此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性）。

复性的温度 PCR 扩增是否顺利的关键因素，通常在50-60℃之间。具体的温度主要由引物的Tm值决定。延伸温度绝大多数设定为72℃ 。如果复性的温度很高，可以将延伸温度和复性温度设置成同一温度，变成二步法PCR 。

变性步骤一般使用 30 秒钟，如果模板的 G+C 含量较高，或直接用细胞做模板，变性时间可适当延长。复性时间有 30 秒种一般是足够的。延伸时间由扩增产物的大小决定，一般采用 1kb 用 1 分钟来保证充足的时间。

参考资料来源：百度百科-PCR反应循环参数