Question

原核生物蛋白质合成过程（论述）

Answer 1

Duolink PLA技术可通过同一个实验即可完成对蛋白质互作及其修饰的检测、定量以及确定细胞定位等。Duolink基于原位PLA技术（即邻位连接分析技术），可以帮助您在内源蛋白质表达过程中进行该分析。

Answer 2

核糖体在进行的蛋白质生物合成分为起始，延伸和终止3个阶段。除了核糖体组成、各种因子、起始tRNA不同外，其余环节在真核生物和原核生物基本类似。
1.首先进行氨酰-tRNA的活化，这能使每个AA和tRNA分子共价连接，以确保加入正确的AA（即接头）作用；并能使aa与延伸中的多肽链末端反应形成新的肽链。
活化步骤：1）aa+ATP=aa-AMP+PPi 2)aa-AMP+tRNA→aa-tRNA+AMP+PPi
2.合成的起始：
1)起始tRNA识别AUG(起始密码子）编码甲硫氨基酸，以确定翻译的正确阅读框架。
2)30S核糖体小亚基中的16SrRNA与富含嘌呤并位于AUG起始密码子的5’端的Shine-Dalgarno序列结合，然后，核糖体沿着mRNA向3‘端移动，直到遇到AUG起始密码子。因而Shine-Dalgarno序列将核糖体亚基传送至正确的AUG用于起始翻译。
3）然后起始因子开始催化蛋白质的合成。原核生物中用三种起始因子IF1、IF2、IF3是必需的。
a.三元复合物(IF3-30S亚基-mRNA三元复合物形成。
b.30S前起始复合物(IF2-30S亚基-mRNA-fMet-tRNAMef复合物)形成，此步亦需要fGTP和Mg2+参与。
c.70S起始复合物(70S initiation complex)形成。50S亚基与上述的30S前起始复合物结合，同时IF2脱落，形成70S起始复合物，即30S亚基-mRNA-50S亚基-fMer-tRNA Met复合物。此时fMet-tRNA Met占据着50S亚基的肽酰位（peptidyl site，简称为P位或给位），而50S的氨基酰（aminoacyl site，简称为A位或受位）暂为空位。
3.肽链合成的延长
这一过程包括进位、肽键形成、脱落和移位等步骤。肽链合成的延长需两种延长因子(Elongationfactor，简写为EF），分别称为EF-T和EF-G.此外尚需GTP供能加速翻译过程。
①进位
结合在mRNA上的fMet-tRNAiMet（或肽酰-tRNA）占着P位，新的氨酰-tRNA和EF-Tu及GTP形成的AA-tRNA·EF-Tu·GTP利用GTP水解的能量进入A位，并与mRNA上相应的密码子结合。
EF-Tu·GDP由EF-Ts协助再生成EF-Tu·GTP。
②肽键形成
50S亚基上肽酰转移酶催化P位的肽（氨）酰-tRNA把肽（或氨酰基）转给A位的AA-tRNA，并以肽键相连。P位的氨基酸(或肽的C端氨基酸)的α-COOH基，与A位氨基酸的α-NH2形成肽链。催化肽键形成的是23SrRNA的肽酰转移酶活性。
③脱落
在A位上的tRNA负载着二肽酰基（或肽酰基），P位上成为无负载的tRNA脱落。
④移位
在EF-G协助下，由EF-G·GTP提供能量，核糖体构象改变，沿mRNA的5’→3’相对移动一个密码子距离，使下一个密码子定位于A位，原来处于A位上的肽酰tRNA转移到P位上，空出A位点。
再依次进位、形成肽键、脱落和移位循环返复，直到mRNA上的终止密码子进入A位，翻译终止。
肽链的延伸是从N端开始。延长过程每重复一次，肽链延伸一个氨基酸残基，多次重复使肽链增长到必要的长度。
4.肽链合成的终止(termination)
肽链合成的终止，需释放因子(releasing factor，RF)参与。原核生物的RF1识别UAA、UAG；RF2识别UAA、UGA，使肽链释放，核糖体解聚。
原核和真核的核糖体释放因子RF1、RF2、eRF1或RF3、eRF3都有和延伸因子EF-G C端同源的保守基序，而EF-G C端的3个结构域又分别和tRNA的氨基酸柄、反密码子螺旋、T柄结构相似。由于RF与tRNA结构相似，所以可通过tRNA的反密码子与终止密码子互作而识别终止密码子。
RF3、eRF3与EF-G的N端和EF-Tu相似，所以RF1/2-RF3、eRF1/eRF3复合物和EF-G或EF-Tu-GTP-氨酰tRNA三元复合物相似。当终止密码子进入A位，由于RF1/2-RF3或eRF1/eRF3可识别终止密码子而进入A位。貌似氨酰tRNA的终止密码子无法接受P位转来的肽基，翻译就此终止。

Answer 3