Question

Don't do that again和 Don't do that it again 有区别吗？请老师指教

Answer 1

没有Don't do that it again. 要么用Don't do that again.要么用Don't do it again. 意思是：不要再那样做了。
句子中的第一个don't 为助动词，第二个do为实意动词， 实意动词后面直接加宾语，这里的宾语是指代前面所说的意见事情，故用指示代词that或it. 但不能两个一起用，否则就造成重复。