Question

组织培养育苗分哪些阶段？

Answer 1

1.无菌培养物的建立

（1）外植体的选择

从植物体上切取下来用于组织培养的部分称为“外植体”。某种植物组织培养成功与否和外植体的选择是否适当有密切关系。选择什么样的外植体，首先取决于下阶段芽的增殖所采用的途径。

如果用侧芽增殖进行繁殖，可以切取植物枝条的顶芽和侧芽。多年生木本植物随年龄的增加，分生组织、茎尖和芽的培养困难也就增大了。若能从幼苗上取得材料则多数情况下会容易些。许多草本花卉的顶芽和植株上部的芽做分生组织和茎尖培养时成功率就比较高。

通过产后不定芽的增殖途径时，可根据不同的花卉种类使用不同的外植体。大多数在花卉园艺栽培中用容易产生不定芽的器官作外植体，在培养中也容易产生不定芽。如非洲紫罗兰、大岩桐和各种秋海棠的叶片；玉簪等花卉的花器官；百合、水仙等的鳞片或叶基部。

在利用体细胞产生胚状体为增殖途径时，常使用胚、分生组织或生殖器官作为外植体。

（2）外植体的灭菌

从植物体上切取的任何外植体在接种到培养基上之前必须经过严格的灭菌处理，将外植体表面的各种微生物全部去掉或杀死，同时还必须保存外植体的生活力。因此，使用什么灭菌剂、多大浓度、处理多长时间，必须根据不同植物材料对灭菌剂的反应来决定。

目前，经常使用的灭菌剂有次氯酸钠（商品名称为安替福民）、双氧水、升汞等药的水溶液。茎尖、茎段和叶片等的灭菌，通常先用流动的自来水冲洗30分钟以上，再在70%酒精中迅速地浸一下（约2～3秒钟），再移至2%～10%次氯酸钠水溶液中或0.1%～0.2%升汞溶液中浸泡3～5分钟。使用的浓度和处理的时间长短，需视外植体的老嫩、角质层厚薄来决定，灭菌后立即用无菌水（经过灭菌的水）冲洗3次以上，升汞需多次冲洗，以去掉残存的汞离子。

（3）外植体的接种

工作人员接种前需剪指甲，用肥皂和流动的自来水洗净双手，戴口罩、帽子、穿工作服。双手在接种前还需再用70%酒精擦拭。工作时不要讲话。

经过灭菌的外植体在无菌的条件下接种到已备好的培养基上。通常这一工作必须在超净工作台上进行。提前20分钟将超净台启动，并用70%酒精擦净台面。开始工作时先点燃酒精灯。接种时，先在超净台内打开培养基瓶口的包纸，在火焰上烤一下瓶口，再开启瓶盖。用无菌刀（在火焰上烤过）根据需要将外植体切块，再用无菌镊子将外植体小心地放在培养基的表面。再用火焰烤一下瓶口和瓶盖后，盖好，包上原来的牛皮纸。如此，即完成一瓶的接种工作。接种后及时写好记录和标签。

2.芽的增殖

外植体接种在培养基上以后是通过三条途径来增殖的：侧芽不断形成和生长、外植体或愈伤组织上产生不定芽和胚状体。目前在花卉快速繁殖的组织培养中，使用最多的是侧芽和不定芽。

（1）促进侧芽的大量分化和生长

高等植物的叶腋间都有腋芽，也叫侧芽，有条件时侧芽可以萌发、生长。用外源的细胞分裂素可以打破顶端优势对侧芽生长的抑制，从而促进侧芽的分化和生长。利用这一方法，在培养基中添加适量的细胞分裂素（有时也加入少量生长素），由于细胞分裂素的持续作用，侧芽不断分化和生长，逐渐形成芽丛。反复切割并转接到新的培养基中继代培养，即可在短期内得到大量的芽。

有些植物种类，即使在含有细胞分裂素的培养基上顶端优势也不能打破，接种的茎尖和芽不分枝，只长成一条茎。在这种情况下可以用切段法，把茎分切成许多段，使每段带有一枚叶片，即一个侧芽，再接种在培养基上，使侧芽萌发、生长、伸长。如此继代培养，加速繁殖。这种做法实际上是在试管内进行微型扦插繁殖。在国内马铃薯和葡萄的快速繁殖（组织培养）就是采用这种方法。

在花卉的组织培养快速繁殖中，上述两种方法结合使用，效果更好。

为促进侧芽分化和生长，在培养基中添加细胞分裂素的浓度为0.1～10毫克/升。常用浓度1～2毫克/升，也有使用高浓度的。在几种细胞分裂素中用得最多的是六苄基氨基嘌呤、细胞激动素和异戊基腺苷。

在使用细胞分裂素的同时，往往还加放少量生长素，以促进侧芽的生长。常用的有萘乙酸、吲哚丁酸、吲哚乙酸。也可用赤霉素，使用浓度为0.05～1毫克/升。

用侧芽增殖法繁殖出来的后代，能保持原品种的优良特性，不因培养条件的影响发生变异。这一点对花卉园艺作物的繁殖是十分重要的。

（2）诱导不定芽

外植体上现存的顶芽和侧芽以外的任何组织器官上形成的芽，称为不定芽。许多花卉在一般的栽培条件下，其器官上可以产生不定芽。如蟆叶秋海棠、非洲紫罗兰的叶片在扦插床上，每枚叶片可以产生十几个芽。在组织培养的条件下，加上植物激素的作用，可以使这种能力得到很好的发挥，每个叶片的切块在培养基上可产生成千上万个芽。

另外，在组织培养的条件下，能使通常不能产生芽的器官产生不定芽，如玉簪的花蕾等。

诱导外植体产生不定芽，所使用的细胞分裂素和生长素的比例，多半是前者大于后者，也有时两者相等。常用的细胞分裂素有六苄基氨基嘌呤、细胞激动素和玉米素。其浓度在0.1～10毫克/升范围内。生长素是萘乙酸、吲哚丁酸和吲哚乙酸。使用浓度低于细胞分裂素。

3.根的诱导

在分化侧芽和不定芽的培养基上长出的芽或嫩枝，一般情况下是不会产生根的。必须将高1～3厘米的芽切下，接种到无激素的培养基上生根。多数花卉的嫩枝本身可以产生丰富的生长素，促进生根。有些花卉需要在生根培养基中加放少量的生长素，如萘乙酸、吲哚丁酸、吲哚乙酸等，浓度约为0.05～5毫克/升。也可将嫩枝剪下出瓶，插在扦插床上发根。多数情况下草本植物比木本植物生根容易；在栽培中扦插容易生根的花卉，试管培养中也易生根。

在诱导生根的过程中使用的基本培养基与第一阶段相同，还可以使用原培养基浓度1/2或1/3或1/4的培养基。糖的浓度可降至1.0%～1.5%，以增强植物的自养能力。这时期还可以相应地提高光照强度。琼脂的用量可降至0.8%。这样，在小苗出试管时根的损伤小，带的琼脂少而稀薄，容易洗净，不易发霉、腐烂，易成活。

4.试管苗出瓶和移栽

试管苗在瓶内，处于光照和温度恒定、无菌、高湿的环境中，与瓶外的环境相差甚大。若直接将小苗移出栽植，容易死亡。为增加试管苗对外界的适应能力，需逐步地对小苗进行锻炼。

试管苗出瓶前需打开瓶塞，锻炼1～2天。但不要时间太长，否则培养基会生霉，导致小苗腐烂。

从试管中取出小苗时尽可能不带或少带培养基。取出后用清水轻轻将根部残存的培养基洗去，再栽种到培养土中。

栽植试管苗可用浅盆或温床，土壤可用透水、通气好的腐叶土或泥炭土加1/3的珍珠岩，也可用砂壤土。土壤最好经过蒸气灭菌，以免病虫危害。栽植的方法可能参照播种繁殖中移苗的做法。移苗初期注意保持较高的温度（20～25℃）和湿度。