Question

你好，想问你几个western的问题，望你请教！谢谢

做western的时候我的目的蛋白是90kda 大概需要什么条件才能转膜完全呢？
看了相关资料，有人在转膜缓冲液中加了SDS有的人则没加，这是为什么呢？我的目的蛋白最好加还是不加？是否会出现过转的现象呢？胶上的蛋白用考马斯亮蓝染后发现都没条带了，但是最后曝光还是没做出结果来，会不会出现过转了？我的一抗验证过没问题，是用santa cruze的~还有我的目的蛋白在总蛋白中含量比较低的~可是我上样量已经达到50ug了！现在不知道还能采用什么方法来解决！希望你能给我个好建议哦！谢谢~

Answer 1

1. 如果是全湿转膜，建议用100V1小时。要加冰。
2. 你会不会极性放反了？胶里面的蛋白Marker是否转到膜上？
3. SDS如果跑的时候加过了，就不一定要加。
4. 胶上的蛋白用考马斯亮蓝染后发现都没条带了。说明过头了。一般都会留些在胶里，尤其是大分子量的。

Answer 2

SDS的加入一般是根据缓冲液的不同和蛋白本身的极性不同而有所不同的。具体实验过程中我的是非极性越大，用SDS越不好。具体的原理没有深究过，不好意思。胶上没有条带了并不代表就一定在膜上，建议你同时转个带色Marker看一下转膜效果。另外具体的转膜条件也可以用带色Marker进行预实验。还有就是膜的染色方法，我原来有遇到过只有免疫荧光法才能出条带的情况，是由于蛋白含量过低造成的。另外就是你要看一下膜的截留分子量，有很多种不同的膜，对应不同大小的蛋白，如果截留分子量大于你的蛋白分子，就会找不到条带。
至于蛋白含量的问题，你可以通过加大培养量，然后浓缩的方法得到。我原来有用过2L培养瓶进行培养，然后低温离心取上清液，用膜包进行浓缩，有专门的膜浓缩包，选不同的截留分子量，浓缩效果很明显，我浓缩了40倍，效果还不错，推荐你也尝试一下。只是浓缩包比较贵，厂家推荐一次性使用，但我当时用酸碱水清洗，也能凑合多用几次。
以上，希望对你有帮助。另外Western的条件其实必须自己多次预实验摸索，标准方法在小分子蛋白的时候都不靠谱，只能自己一点点来。祝你早日得到漂亮的图~

Answer 3

1. 如果是全湿转膜，建议用100V1小时。要加冰。
2. 你会不会极性放反了？胶里面的蛋白Marker是否转到膜上？
3. SDS如果跑的时候加过了，就不一定要加。
4. 胶上的蛋白用考马斯亮蓝染后发现都没条带了。说明过头了。一般都会留些在胶里，尤其是大分子量的。 SDS的加入一般是根据缓冲液的不同和蛋白本身的极性不同而有所不同的。具体实验过程中我的是非极性越大，用SDS越不好。具体的原理没有深究过，不好意思。胶上没有条带了并不代表就一定在膜上，建议你同时转个带色Marker看一下转膜效果。另外具体的转膜条件也可以用带色Marker进行预实验。还有就是膜的染色方法，我原来有遇到过只有免疫荧光法才能出条带的情况，是由于蛋白含量过低造成的。另外就是你要看一下膜的截留分子量，有很多种不同的膜，对应不同大小的蛋白，如果截留分子量大于你的蛋白分子，就会找不到条带。
至于蛋白含量的问题，你可以通过加大培养量，然后浓缩的方法得到。我原来有用过2L培养瓶进行培养，然后低温离心取上清液，用膜包进行浓缩，有专门的膜浓缩包，选不同的截留分子量，浓缩效果很明显，我浓缩了40倍，效果还不错，推荐你也尝试一下。只是浓缩包比较贵，厂家推荐一次性使用，但我当时用酸碱水清洗，也能凑合多用几次。
以上，希望对你有帮助。另外Western的条件其实必须自己多次预实验摸索，标准方法在小分子蛋白的时候都不靠谱，只能自己一点点来。祝你早日得到漂亮的图~ 1、过转一般只会出现在分子量很小的蛋白身上，90KD绝对不小了，而且现在膜的制作工艺有改进，很少会把蛋白转飞了。不放心的话可以在转完之后用丽春红染膜看一下。
2、如果目的蛋白含量低，可以尝试用高灵敏度的ECL底物，检测pg级的蛋白。同时延长曝光时间，一直做到非目的带出来，看看能不能找到你的目的蛋白
3、santa的抗体很烂，非常烂，有别的选择就别选santa的，当然更别选国产的

Answer 4

1、过转一般只会出现在分子量很小的蛋白身上，90KD绝对不小了，而且现在膜的制作工艺有改进，很少会把蛋白转飞了。不放心的话可以在转完之后用丽春红染膜看一下。
2、如果目的蛋白含量低，可以尝试用高灵敏度的ECL底物，检测pg级的蛋白。同时延长曝光时间，一直做到非目的带出来，看看能不能找到你的目的蛋白
3、santa的抗体很烂，非常烂，有别的选择就别选santa的，当然更别选国产的