可逆末端终止测序法的原理？
双脱氧末端终止法
在模板指导下，聚合酶不断将dNTP加到引物的3’-OH末端，使引物延长，合成出新的互补的DNA链，如果加入双脱氧三磷酸核苷(ddNTP）,由于双脱氧核糖的3’位置上缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，即形成一种全部具有相同5’-引物端和以ddNMP残基为3’端结尾的一系列长短不一片段的混合物。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸的单链DNA，从而读取DNA的核苷酸序列。
双脱氧链终止法 是现在应用最多的核酸测序技术，由Sanger等1977年提出。
其原理是：核酸模板在核酸聚合酶、引物、四种单脱氧碱基存在条件下复制或转录时，如果在四管反应系统中分别按比例引入四种双脱氧碱基，只要双脱氧碱基掺入链端，该链就停止延长，链端掺入单脱氧碱基的片段可继续延长。如此每管反应体系中便合成以共同引物为5’端，以双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后，分四个泳道进行电泳。以分离长短不一的核酸片段(长度相邻者仅差一个碱基)，根据片段3’端的双脱氧碱基，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。
(一) Sanger双脱氧链终止法(酶法)测序程序 操作程序是按DNA复制和RNA反转录的原理设计的。
分离待测核酸模板，模板可以是DNA，也可以是RNA，可以是双链，也可以是单链。
2.在4只试管中加入适当的引物、模板、4种dNTP(包括放射性标记dATP，例如?32 PdATP和DNA聚合酶（如以RNA为模板，则用反转录酶），再在上述4只管中分别加入一种一定浓度的ddNTP(双脱氧核苷酸)。
3.与单链模板（如以双链作模板，要作变性处理)结合的引物，在DNA聚合酶作用下从5’端向3’端进行延伸反应，32P随着引物延长掺入到新合成链中。当ddNTP掺入时，由于它在3’位置没有羟基，故不与下一个dNTP结合，从而使链延伸终止。ddNTP在不同位置掺入，因而产生一系列不同长度的新的DNA链。
4.用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳同时分离4只反应管中的反应产物，由于每一反应管中只加一种ddNTP(如ddATP)，则该管中各种长度的DNA都终止于该种碱基(如A)处。所以凝胶电泳中该泳道不同带的DNA 3’ 末端都为同一种双脱氧碱基。
5.放射自显影。根据四泳道的编号和 每个泳道中DNA带的位置直接从自显影图谱上读出与模板链互补的新链序列。
双脱氧末端终止法
在模板指导下，聚合酶不断将dNTP加到引物的3’-OH末端，使引物延长，合成出新的互补的DNA链，如果加入双脱氧三磷酸核苷(ddNTP）,由于双脱氧核糖的3’位置上缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，即形成一种全部具有相同5’-引物端和以ddNMP残基为3’端结尾的一系列长短不一片段的混合物。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸的单链DNA，从而读取DNA的核苷酸序列。
双脱氧链终止法 是现在应用最多的核酸测序技术，由Sanger等1977年提出。
其原理是：核酸模板在核酸聚合酶、引物、四种单脱氧碱基存在条件下复制或转录时，如果在四管反应系统中分别按比例引入四种双脱氧碱基，只要双脱氧碱基掺入链端，该链就停止延长，链端掺入单脱氧碱基的片段可继续延长。如此每管反应体系中便合成以共同引物为5’端，以双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后，分四个泳道进行电泳。以分离长短不一的核酸片段(长度相邻者仅差一个碱基)，根据片段3’端的双脱氧碱基，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。
(一) Sanger双脱氧链终止法(酶法)测序程序 操作程序是按DNA复制和RNA反转录的原理设计的。
分离待测核酸模板，模板可以是DNA，也可以是RNA，可以是双链，也可以是单链。
2.在4只试管中加入适当的引物、模板、4种dNTP(包括放射性标记dATP，例如?32 PdATP和DNA聚合酶（如以RNA为模板，则用反转录酶），再在上述4只管中分别加入一种一定浓度的ddNTP(双脱氧核苷酸)。
3.与单链模板（如以双链作模板，要作变性处理)结合的引物，在DNA聚合酶作用下从5’端向3’端进行延伸反应，32P随着引物延长掺入到新合成链中。当ddNTP掺入时，由于它在3’位置没有羟基，故不与下一个dNTP结合，从而使链延伸终止。ddNTP在不同位置掺入，因而产生一系列不同长度的新的DNA链。
4.用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳同时分离4只反应管中的反应产物，由于每一反应管中只加一种ddNTP(如ddATP)，则该管中各种长度的DNA都终止于该种碱基(如A)处。所以凝胶电泳中该泳道不同带的DNA 3’ 末端都为同一种双脱氧碱基。
5.放射自显影。根据四泳道的编号和 每个泳道中DNA带的位置直接从自显影图谱上读出与模板链互补的新链序列。
