Question

质粒DNA酶切不完全的可能原因有哪些

Answer 1

质粒DNA酶切不完全的可能原因：

1. 质粒的量以及酶切时间都会有影响。

2. 质粒浓度过大，建议放大酶切体系，减少质粒浓度。

3. 可能是由于加的限制性内切酶的量不够。

4. 酶切的时间不充足。

5. 质粒DNA的质量。

6. 限制性内切酶的活性。

质粒DNA酶切原理：

1. 限制性内切酶（restriction endonuclease）:一种在特殊核甘酸序列处水解双链DNA的内切酶。 

2. 限制性内切酶能特异性地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异性位点上，并切割双链DNA。生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。它是可以将外来的DNA切断的酶，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶。

3. DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现的。它是一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5'-PO4与另一DNA链的3'-OH生成磷酸二酯键。但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的(T4DNA连接酶除外)，而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA连接酶催化成磷酸二酯键。

4.  常用的DNA连接酶有两种：来自大肠杆菌的DNA连接酶和来自噬菌体的T4DNA连接酶。二者的作用机理类似。

Answer 2

质粒浓度过大，建议放大酶切体系，减少质粒浓度。另外可能是由于加的限制性内切酶的量不够。或者是酶切的时间不充足。