Question

谁有可表达T7RNA聚合酶的载体

Answer 1

通过大肠杆菌表达目的基因大量获得重组蛋白是一个方便快捷的方法。植物中克隆的目的基因被克隆到特异设计的质粒载体上，受噬菌体T7强启动子控制;表达由宿主细胞提供的T7 RNA聚合酶诱导。当需要表达蛋白时，在细菌培养基中加入IPTG来启动表达。不同载体在邻近克隆位点处具有编码不同的多肽“标签”的序列，在定位、检测或纯化目的蛋白时提供方便。以pET-32a(+)为例，介绍将目的基因克隆进载体并进行表达获得重组蛋白的过程，从而熟悉根据自己的要求采用不同的载体进行原核表达的全过程。1.准备工作(试剂配置和器材准备)1)操作流程示意图主要步骤操作①制备pET-32a(+)载体 用限制性酶消化，去磷酸化后胶纯化回收②制备插入DNA PCR装入质粒后进行限制性消化，再回收③插入片段克隆到pET-32a(+)载体 插入片段与pET连接，转化④转化表达宿主菌BL21 转化带有T7RNA聚合酶基因的菌株⑤诱导表达目的蛋白 SDS-PAGE，Western 印迹、定量分析确定目的蛋白⑥放大试验纯化目的蛋白 放大试验，制备粗提物，亲和纯化，切除融合标签2)配制生长培养基如LB，和100mM IPTG,50μg/ml 卡那霉素存储液。3)宿主菌的保存。长期存放菌株和pET重组子应保存于甘油中。4)感受态细胞的制备，参照其它试验手册。2.操作步骤[1] 制备载体1)载体消化和胶纯化3μg pET载体3μl 10×限制性内切酶buffer10-20U 两种酶(是否共用buffer; 酶体积不要超过反应体系的10%)3μl 1mg/ml乙酰BSA(根据需要补足水到30μl2)37℃温浴2-4h3)取3μl样品进行电泳检测消化反应进行的程度4)消化完全后，加入0.05U小牛碱性磷酸酶，37℃ 30min5)全部样品在1%琼脂糖胶上电泳，切带按照胶回收试剂盒说明回收目标片段。6)-20℃保存备用。[2]制备插入片段限制性消化和胶纯化是制备插入片段的常规方法。一般先用PCR扩增带酶切位点的目标基因，克隆进T-载体，然后用与消化载体相同的内切酶进行消化和胶回收。但在PCR过程中，需要减少突变的发生，可采用高保真酶，尽量减少PCR循环次数，增加模板和引物的浓度。[3]在pET32a载体中插入片段连接反应2μl 10×连接buffer2-5μl 50ng/μl 预制的pET32a载体1μl T4连接酶5-7μl 预制目标基因插入片段加水到20μl，枪头混匀，16℃反应2h-过夜[4]转化转化方法同T-载体转化大肠杆菌DH5α一样，既可转化BL21也可转化DH5α，若转化DH5α，需要重新抽提质粒，再转化BL21。筛选LB平板需含50μg/μl 卡那霉素。[5]pET重组子鉴定如果亚克隆成功，阳性菌落数远大于阴性菌落。检验转化子的方法很多，包括PCR、质粒抽提及酶切分析、测序，体外转录和翻译。[6]DE3溶原菌的诱导表达(1)、从新鲜的划线平板中挑取单克隆到50ml含50μg/μl 卡那霉素的液体培养基中，37℃培养至OD600为0.4-1。(2)、培养基中加入100mMIPTG至终浓度为0.4mM(T7启动子)或1 mM(T7lac启动子)，继续培养2-3小时。(3)、将摇瓶置于冰上5min，5000g 4℃离心5min收集菌体。(4)、重悬细胞于0.25倍体积预冷的20mMTris-HCl (pH8.0)中，离心。(5)、除去上清，菌体保存于-70℃或继续纯化。[7]SDS-PAGE进行目标蛋白质分析(1)、机械破碎细胞。一般用弗氏压碎法或超声波处理。(2)、裂解液14000g离心10min，分离可溶和不溶部分。(3)100μl可溶上清中加入100μl 4×SDS上样buffer和水。85℃迅速加热3min使蛋白变性，然后上样进行SDS-PAGE分析，观察蛋白表达。(4)若目标蛋白在不溶部分中，需进行包涵体纯化。750μl20mMTris-HCl,pH7.5重悬沉淀，离心10000g5min,除去上清重复洗涤。然后1.5ml 1%SDS上样buffer中重悬沉淀，重复(3)的步骤进行SDS-PAGE分析。3.总结(注意事项)(1)所有操作尽量在冰上操作，以避免蛋白质发生变性;(2)根据自己的需要选择不同的表达载体，并注意不同的表达载体上的融合标签和携带的抗性基因，其中有些标签是可以去除的。(3)构建好的载体最好进行测序验证，保证读码框正确，即没有移码。(4)长期保存的pET重组子在高浓度甘油(19%)中会导致质粒不稳定。(5)T7lac启动子是严谨启动子，IPTG诱导时可以优化最佳浓度(25uM-1mM之间)使目的蛋白达到最佳的活性和溶解性。(6)37℃生长常常会使一些蛋白累积形成包涵体，而30℃生长则可能产生可溶的和有活性的蛋白。在某些情况下，低温(15-20℃)延长诱导时间(过夜)可以使溶解性蛋白的产量达到最大。(7)进行SDS-PAGE分析时，需优化电泳上样体积。