Question

为什么用限制酶1切质粒，限制酶2切目的基因？？？一直不懂啊~质粒不是应该切个口就好了吗？拜托大家啦！~

Answer 1

1楼，你也太科普了吧。。。
楼主，是这样的，这个题目的条件有点不全，但是我们可以得到这样的信息：
把识别GGATCC的酶叫做E1，把识别GATC的酶叫E2，那么：
1）E2也可以识别E1的酶切序列（都有GATC）
2）E2切下来漏出的末端可能可以与E1匹配，也可能不行，这取决两种假设：a如果两个酶切后留下的都是粘性末端，而且露出的末端都是GATC，那么根据碱基互补配对原则E1切下后露出的末端也可以与E2切下的末端互补，最终发生DNA的链接（在T4 ligase作用下）
b 如果两个酶切留下的都是平端，那么平端对平端也可以发生链接 （也是在T4 ligase作用下），这是我们实验中将不同酶切片段连接起来的一种方法，事实上，比如两个酶切后留下的都不是相互互补的末端，但是我们使用Klenow大片段酶作用依然可以将末端补平，这样还是可以连接

除了ab两种假设外，E2切下的片段将不能和E1切口发生互补连接。

这个质粒构建的方法就是建立在E2切下的末端可以与E1切下的粘性末端互补这一假设上，
如果质粒用E2切的话，那么质粒会被切成两端，作为一个质粒来讲，丢失任何一个那么大的片段（从图上看差不多有一半了）都会产生不完整的质粒而且无法再细菌里复制，而且用E2切后质粒将同时丧失氨苄和四环素两种抗性，不便于后期转化后筛选，所以不能选用E2或者E2+E1双酶切

对于你要做的片段而言，它就不存在这个问题，用E1+E2切后将露出相同的GATC粘性末端，而质粒用E1切后变成一个线性质粒没有丧失任何元件，但是露出了GATC末端（两端都是，这个你可以理解吧）。那么片段和质粒都有相同的粘性末端，在T4连接酶作用下是非常容易发生连接的。只不过有两种连接方向（这个你也可以理解吧。。）
而且这个设计巧妙之处在于，插入目的片段后，四环素的基因被破坏了（你在四环素里插了那么大的片段，基因很可能非正常转录或翻译），因此质粒将不具有编码四环素抗性蛋白，那么转化入成功插入目的片段的工程菌将不具有四环素抗性而只具有氨苄抗性。

如有不明白可以跟我再补充或直接站内信联系

追问

谢谢你啊，太辛苦了！~！~！
可不可以这么说：
用酶2切目的基因，就会使目的基因多了许多，然后自己找合适的与质粒重组~
为什么要使质粒不具有四环素抗性蛋白，是便于筛选吗？
那如果有四环素抗性蛋白，不是也可以在筛选的培养基中加入四环素来选择吗？

追答

不是便于筛选，而是便于验证。。就是插入失活的质粒应该不具有四环素抗性，那么带有这个质粒的菌株应该也不具有，只是再次做个验证而已:)

Answer 2

你想一下，要是只切个口，只是使环状的质粒断开，那要把目的基因接到质粒上去岂不是得把质粒硬掰啊O(∩_∩)O哈哈~

其实无论是质粒还是目的基因都要用同种限制酶来切割的。先用限制酶1，2切割质粒，使质粒上有空位可以来接上目的基因，再用同种限制酶1，2切割含有目的基因的一段DNA片段，获取目的基因

Answer 3

首先把目的基因切下来要用到限制酶2.
如果再用限制酶2切割质粒，则两个标记基因都被切开，标记基因将失去作用
而用酶1切割的质粒可保留一个标记基因，而产生的黏性末端和限制酶2切割下来的目的基因可以互补配对。
提示一下;质粒是环状的DNA分子