Question

谁知道RT－PCR怎么做啊？谢谢

关于RT-PCR的资料 越详细越好 谢谢

Answer 1

　　RT-PCR步骤
　　总RNA提取
　　1. 取200mg组织，放到1.5ml EP管中，加入1ml Trizol剪碎。
　　2. 震荡30s。
　　3. 加0.2ml氯仿，剧烈摇动30s，室温3min。
　　4. 12000×g，4℃ 离心，15min。
　　5. 吸上层无色水相，移入另一EP管中（约0.5ml）。
　　6. 加等体积异丙醇，-20℃，30min。
　　7. 12000×g，4℃ 离心，10min。在管底部可见微量RNA沉淀
　　8. 弃上清，加75％乙醇1ml，振荡。
　　9. 7500×g，4℃ 离心，10min。
　　10. 弃上清，用滤纸小心吸取残留液体，室温干燥5－10min。
　　11. 沉淀溶于20μl DEPC水，取1μl加入79μl DEPC水测OD260/OD280
　　12. 计算浓度与纯度，－70℃保存。
　　OD260×40×稀释倍数
　　RNA浓度（μg/μl）＝————————————
　　1000
　　逆转录合成 cDNA
　　反应体系如下
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　　MgCl2 2μl
　　10×RT Buffer 1μl
　　RNase Free dH2O 3.75μl
　　dNTP Mixture(各10mM) 1μl
　　RNase Inhibitor 0.25μl
　　AMV Reverse Transcriptase 0.5μl
　　Random 9 mers 0.5μl
　　Positive Control RNA (1μg) 1μl
　　混匀快速离心一次
　　反应条件如下
　　30℃ 10min
　　42℃ 30min
　　99℃ 5min
　　5℃ 5min
　　-20℃ 冰箱冻存
　　PCR反应
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　　摸板cDNA 2.5μl
　　5×PCR Buffer 2.5μl
　　灭菌蒸馏水 7.2μl
　　聚合酶 Ex Taq HS 0.1μl
　　上游引物 0.1μl
　　下游引物 0.1μl
　　—————————————————————————————
　　Total 12.5μl
　　混匀快速离心一次
　　反应条件
　　94℃ 2min 1Cycle
　　94℃ 40sec ┓
　　50-65℃ 40sec ┃ 25-35Cycles
　　72℃ 1min ┛
　　72℃ 5min 1Cycle
　　PCR产物-20℃冰箱保存
　　取PCR产物8μl 加5×Loading Buffer 2μl 2%琼脂糖凝胶电泳120V
　　100mA 30min 溴化乙锭染色，凝胶成象仪成象并保存结果