Question

酶联免疫吸附测定实验（ELISA）的操作流程，谢谢大家

Answer 1

　　Elisa 操作流程（以人IL-4 ELISA KIT为例）：
　　检测原理:
　　本实验采用双抗体夹心ELISA法。抗人IL-4单抗包被于酶标板上，标本和标准品中的IL-4会 与单抗结合，游离的成分被洗去。加入生物素化的抗人IL-4抗体和辣根过氧化物酶标记的亲 和素。生物素与亲和素特异性结合；抗人IL-4抗体与结合在单抗上的人IL-4结合而形成免疫 复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物，若反应孔中有IL-4，辣根过氧化物酶会使无色 的显色剂现蓝色，加终止液变黄。在450nm处测OD值，IL-4浓度与OD450值之间呈正比，可 通过绘制标准曲线求出标本中IL-4的浓度。
　　试剂盒组成：
　　1．抗体预包被酶标板（8×12 或 8×6）
　　2．冻干标准品（2 / 1 支；0.5ng/支）
　　3．标准品和标本稀释液（橙盖瓶）（1 瓶；20ml/12ml）
　　4．浓缩生物素化抗体（紫盖瓶）（1 支）
　　5．生物素化抗体稀释液（蓝盖瓶）（1 瓶；16ml/10ml）
　　6．浓缩酶结合物（棕盖瓶）（1 支）
　　7．酶结合物稀释液（紫盖瓶）（1 瓶；16ml/10ml）
　　8．浓缩洗涤液 20× （白盖瓶）（1 瓶；50ml/25ml）
　　9．显色底物（TMB）（棕盖瓶）（1 瓶；12ml/6ml）
　　10．反应终止液（红盖瓶）（1 瓶；12ml/6ml）
　　11．封板胶纸（6/3 张）
　　12．产品说明书（1 份）
　　标本收集:
　　1. 收集血液的试管应为一次性的无热原，无内毒素试管。
　　2. 血浆抗凝剂推荐使用EDTA。避免使用溶血，高血脂标本。
　　3. 标本应清澈透明，悬浮物应离心去除。
　　4. 标本收集后若不及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃，-70℃电冰箱内，避免反复冻融，3-6月内检测。
　　5. 如果您的样本中检测物浓度高于标准品最高值，请根据实际情况，做适当倍数稀释(建 议做预实验，以确定稀释倍数)。
　　注意事项:
　　1. 试剂盒使用前请保存在2-8℃。复溶后的标准品应分装后，将其放在-20～-70℃贮存。
　　2. 浓缩生物素化抗体，浓缩酶结合物体积小，运输中颠簸和可能的倒置，会使液体沾到管壁 或瓶盖。因此使用前请用手甩几下或1000转/分离心1分钟，以使附着管壁或瓶盖的液体沉积到管底。取用前，请用移液器小心吹打4-5次使溶液混匀。
　　3. 从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶,属于正常现象，微加热至40℃使结晶完全溶解后 再配制洗涤液。（加热温度不要超过50℃）使用时洗涤液应为室温。
　　4. 若需要分次使用标准品应按照每一次用量分装，将其放在-20～-70℃贮存。避免反复冻 融。
　　5. 不同批号的试剂盒组份不能混用（洗涤液和反应终止液除外）。
　　6. 充分轻微混匀对反应结果尤为重要，最好使用微量振荡器(使用最低频率)，如无微量振荡器，可在反应前手工轻轻敲击酶标板框混匀。
　　7. 在试验中标准品和样本检测时建议作双孔检测。
　　8. 试验中所用的试管和吸头均为一次性使用，严禁在不同的液体之间混用！否则将影响试 验结果。
　　9. 试验中请穿着试验服并带乳胶手套做好防护工作。特别是检测血液或者其他体液标本时， 请按国家生物试验室安全防护条列执行。
　　检测前准备工作:
　　1. 请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，以平衡至室温。
　　2. 将浓缩洗涤液用双蒸水稀释(1:20)。未用完的放回4℃。
　　3. 标准品: 加入标准品/标本稀释液0.5ml至冻干标准品中，静置15分钟，待其充分溶解后，轻轻混匀(浓度为1000 pg/ml)。然后根据需要进行稀释。(建议标准曲线使用以下浓度： 1000、500、250、125、62.5、31.25、15.6、0 pg/ml)。复溶标准品原液（1000 pg/ml）若未用完请分装后放入-20℃以下电冰箱内保存，保存两个月。已稀释的标准品请废弃。
　　4. 生物素化抗体工作液：按当次试验所需要得用量，使用前20分钟，以生物素化抗体稀释液稀释浓缩生物素化抗体(1:30)成工作浓度。当日使用。若实验次数过多导致生物素化 抗体量不足，可向我们公司单独购买生物素化抗体。（须提供抗体批号）
　　5. 酶结合物工作液：按当次试验所需要得用量，使用前20分钟，以酶结合物稀释液稀释浓 缩酶结合物(1:30) 成工作浓度。当日使用。若实验次数过多导致浓缩酶结合物量不足， 可向我们公司单独购买浓缩酶结合物。（须提供酶结合物批号）
　　洗涤方法:
　　1. 自动洗板机：要求注入的洗涤液为350ul，注入与吸出间隔15－30秒。洗板5次。
　　2. 手工洗板：甩尽孔内液体，在洁净的吸水纸上拍干，每孔加洗涤液350ul，静置30秒后甩尽液体，在厚迭吸水纸上拍干。洗板5次。

　　操作步骤:
　　1．从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条，未用的板条和干燥剂请放回铝箔袋内压 实自封条，密封口袋，放回4℃。
　　2．空白孔加标准品和标本稀释液，其余相应孔中加标本或不同浓度标准品(100ul/孔)，用封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱孵育90分钟。
　　3．提前20分钟准备生物素化抗体工作液。
　　4．洗板5次。
　　5．空白孔加生物素化抗体稀释液，其余孔加入生物素化抗体工作液(100ul/孔)。用新封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱孵育60分钟。
　　6．提前20分钟准备酶结合物工作液。避光室温(22-25 ) ℃ 放置。
　　7．洗板5次。
　　8．空白孔加酶结合物稀释液，其余孔加入酶结合物工作液(100ul/孔)。用新封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱，避光孵育30分钟。
　　9．打开酶标仪电源，预热仪器，设置好检测程序。
　　10．洗板5次。
　　11．加入显色底物(TMB)100ul/孔，避光36℃孵箱，避光孵育15分钟。
　　12．加入终止液100ul/孔, 混匀后即刻测量OD450值(3分钟内)。在仪器保存读数结果并打印一份纸质结果。
　　13．实验完毕后将未用完的试剂按规定的保存温度放回电冰箱保存至有效期结束。
　　建议保存酶标板框，以备下次或者今后试验使用。

　　结果判断:
　　1. 每个标准品和标本的OD值应减去空白孔的OD值。
　　2. 手工绘制标准曲线。以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。
　　3. 若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。

　　灵敏度、特异性和重复性:
　　● 灵敏度：最小可测人IL-4达7pg/ml。
　　● 特异性：不与IL－1,2,3,5,6,8,10,12,IFN,TNF及sTNF-RII等反应。
　　● 重复性：板内，板间变异系数均<10%。

Answer 2

（1） 加入50uL的标准品或样品于所设定的孔中；
（2） 在每孔中加入100uL一抗， 轻轻摇动微孔板混匀1分钟；
（3） 室温（22.5±2.5）°C避光孵育30分钟；
（4） 洗板3次，每次加入250uL 1×洗液，最后一次尽量甩干并在吸水纸上吸干；
（5） 每孔加入150uL1×二抗（避免阳光直射和工作台温度过低，孵育时适当覆盖微孔板）；
（6） 室温（22.5±2.5）°C避光孵育30分钟；
（7） 洗板3次，每次加入250uL1×洗液，最后一次尽量甩干并在吸水纸上吸干；
（8） 加入100uL的TMB底物（底物本身无色，出现颜色变化不能使用）；
（9） 室温（22.5±2.5）°C避光孵育孵育10-15分钟，加入100uL的终止液终止反应，在450nm下读OD值(读数前使用无绒布擦拭微孔底部水分和指模)。

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