Question

质粒转染细胞不表达的问题~

想研究某跨膜蛋白，构建真核表达质粒（构建了多种，载体有PCDNA3.1-FLAG,PCDNA3,1-V5,PCMV-5'端MYC,PCDNA3-5'FLAG,PCDNA3-5'HA），转染始终不表达，细胞换过293T,AD293,COS1,COS7等，转染操作的人也换了好几个，始终检测不到目的条带~质粒酶切鉴定和测序都正确，不存在移码和无义突变，启动子序列也正确，起始密码子和终止密码子的问题也考虑了，没有问题。实在想不出有别的什么问题了，希望有人能帮我分析一下，谢谢~

Answer 1

不知道你没杂出条带是因为什么原因，还有你杂交的抗体是目的蛋白的抗体吗？你杂杂标签蛋白试试，看看有没有条带啊？我这么说是因为，膜蛋白确实不好提取，而且提取后可能空间构想改变了，你的抗体可能识别不了了，而标签蛋白是多肽，构象不会受影响，只要不被你的目的蛋白档上就行，所以你可以用标签蛋白的抗体杂交下，试试。一般最好把标签和目的蛋白融合表达一下

Answer 2

你好，我现在也遇到同样的问题。请问你的问题最后是怎么解决的？

Answer 3

换换裂解液试试。