Question

不加保护碱基为什么不能酶切

Answer 1

不加保护碱基不能酶切的原因：保护碱基是为了“保护酶切位点”，所以，只有引物5‘端有酶切位点时，而且想直接酶切PCR产物时，才加保护碱基。

一般来说只要达到规定的保护碱基数目，加什么碱基是没关系的。数目一定要达到。而且为了保证酶切质量一般比推荐的保护碱基数目再加一个或两个。

构建载体的时候，在引物里面引物酶切位点才会加保护碱基的，这个保护碱基是为了让酶能够正确识别酶切位点，如果先把PCR连到T载体上再酶切的话，就不用加任何保护碱基都能正确切下来。

原理

在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。

在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相邻的两个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。

以上内容参考：百度百科-保护碱基