Question

RAPD技术的原理和优缺点是什么

RAPD技术的原理是什么

Answer 1

RAPD技术是建立在PCR技术的基础上，它用一系列(通常数百个)不同的随机排列碱基序列的寡核苷酸单链(一般为10个bp)作为引物，对所研究的基因组DNA进行单引物扩增。模板DNA经90—94变性 解链后在较低温度(36～37℃)下退火，这时形成的单链模板会有许多位点与引物互补配对，在 72℃下，通过链延伸，形成双链结构，完成DNA合成。重复上述过程，即可产生片段大小不等的扩增产物，通过电泳分离和显色便可得到许多不同的条带，从中 筛选出特征性条带。扩增产物片段的多态性反映了基因组DNA的多态性。如果基因组在这些区域内发生DNA片段插入、缺失或碱基突变就可能导致这些特定结合 位点的分布发生相应的变化，而使PCR产物增加、缺少或发生分子量的改变。因此，通过对PCR产物的检测即可测出基因组DNA在这些区域的多态性。进行 RAPD分析时，可用引物的数量很大，虽然对每个引物而言，其检测基因组DNA多态性的区域是有限的，但是利用一系列引物则可以使检测区域几乎覆盖整个基 因组。因此，RAPD可以对整个基因组DNA进行多态性检测。

RAPD技术的优点：
①不使用同位素，减少了对工作人员健康的危害；
②可以在物种没有任何分子生物学研究 的情况下分析其DNA多态性；
③对模板 DNA的纯度要求不高；
④技术简单，无需克隆DNA探针，无需进行分子杂交；
⑤灵敏度高，可提供丰富的多态性；
⑥RAPD引物没有严格的种属界限，同一套 引物可以应用于任何一种生物的研究，因而具有广泛性、通用性。
但是，RAPD技术较易受到各种因素的影响。无论是模板的质量和浓度，短的引物序列，PCR的循环次数，基因组DNA的复杂性，技术设备等，都有可 能是RAPD技术重复性差的直接原因。目前，多从以下几个方面来提高反应的稳定性：
①操作规范，反应体系的组成要力求一致，尽可能地使RAPD反应标准 化；
②提高扩增片段的分辨率；
③将RAPD标记转化为SCAR标记后再进行常规的PCR分析，可以提高反应的稳定性及可靠性。

Answer 2

RAPD，即随机扩增多态性DNA技术，是由美国科学家Wiliams和Welsh于1990年分别研究提出的，又称任意引物PCR。它的应用是基于这样的一个推理：对于同一模板DNA，用同一引物扩增既可能得到相同的带谱（模板基因组间可能具有同源性），也可能得到不同的带谱。仅在某一特定模板中出现的条带就可作为该模板的分子标记。事实上，不同基因组DNA总是一定差异的，所以用RAPD就可以进行分子标记研究。理论上讲，在一定的扩增条件下，扩增的条带数取决于基因组的复杂性。对特定的引物，复杂性越高的基因组所产生的扩增条带数也越多。 90年代前期RAPD技术得到广泛的应用，几乎所有的作物都有这方面的研究报告。但随着研究的深入，人们发现该技术存在一定的缺陷，并对此作了一些探索。RAPD 技术目前运用相当广泛， 几乎渗透于整个基因组研究的各个方面， 这与它所具有的众多优势是分不开的。 ① 无需专门设计RAPD 扩增反应引物，也无须预先知道被研究生物基因组的核苷酸序列，引物可随机合成和随机选定，长度一般为9- 10 个核苷酸； ② 每个RAPD 反应中，仅加单个引物，就可通过引物和模板DNA 随机配对实现扩增，扩增无特异性； ③ 退火温度低，一般为36℃，这样的温度能保证核苷酸引物与模板的稳定结合，同时允许适当的错误配对，以扩大引物在基因组DNA中配对的随机性，使RAPD 有较高的检出率； ④ RAPD 技术简便易行、省时省力，不需要RFLP 分析的预备性工作：如克隆的制备、同位素标记、Southern 印记反应及分子杂交。RAPD 易于程序化，利用一套随机引物可得到大量的分子标记，并可借助于计算机系统进行分析； ⑤ RAPD 分析所需的DNA 样品量极少，仅为RFLP 的1ö 1000 - 1ö 200，这对于生物早期取样鉴定或在DNA 受限制的情况下是十分有利的。