Question

简述革兰氏染色的基本原理和其分类学意义。

Answer 1

G＋菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。呈紫色。
Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，沙黄复染后呈红色。

操作步骤

1 ．涂片

将培养的不同菌分别作涂片（注意涂片切不可过于浓厚），干燥、固定。固定时通过火焰l 一2 次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。

2 ．染色

( 1 ）初染加草酸铰结晶紫一滴，约一分钟，水洗。

( 2 ）媒染滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。

( 3 ）脱色将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95 ％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20 一30 秒钟，立即用水冲净酒精。

( 4 ）复染用番红液染1 一2 分钟，水洗。

( 5 ）镜检干燥后，置油镜观察．革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。

( 6 ) 同法在一载玻片上以大肠杆菌与枯草芽孢杆菌混合制片，作革兰氏染色对比。

革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌：而脱色

不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及

部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。

试验一：培养基的配制

实验目的：

1、 了解培养基的组成，掌握培养基的配制原理和步骤。

2、 了解影响培养基配制的因素。

3、 了解灭菌基本操作。

4、 为植物的离体培养创造营养条件。

实验原理：

培养基的类别，依据培养基中是否加有固化剂可分为固体培养基和液体培养基，前者因加有固化剂如琼脂或卡拉胶而呈固体状态，后者不加固化剂，培养基为液体。依据培养基中是否加有生长调节物质和附加物质，则可将培养基分为基本培养基和完全培养基，前者只含有无机营养物（包括大量元素和微量元素）、维生素、氨基酸、糖类和水，后者在基本培养基的基础上，根据不同试验要求，附加一些物质，如各种植物生长调节剂，以及其他的复杂有机附加物，包括有些成分尚不完全清楚的天然提取物，如椰乳、香蕉汁等。

本次实验目的是配制无菌草莓培养基，故采用MS配方配置固体的基本培养基。

实验原则为：“无菌操作，目标明确，营养协调，ph适宜”。

实验材料与用具

由无机盐、维生素以及在水溶液中稳定的生长调节物质等配制而成的母液，琼脂，蔗糖，蒸馏水，NaOH，HCL，量筒，容量瓶，烧杯，广口瓶，电子秤，玻璃棒，pH试纸，无菌瓶，高温灭菌锅等。

实验步骤

1.母液的配制及保存

2.培养基的煮制

称量好所需的琼脂9.5g、蔗糖、蒸馏水，配好所需用的生长调节物质，准备好分装容器。现在烧杯内放一定量的蒸馏水，加入琼脂9.5g和蔗糖30g并加热溶解，然后按母液顺序，根据不同母液的不同倍数吸取规定的量。加完所有的培养基组分（包括所需的生长调节物质,大量元素25ml，微量元素10ml，铁盐10ml）后，继续加温并不断搅拌，待琼脂完全溶化后定容。

3.pH的调整

用NaOH或HCL来调节溶液的酸碱度。一般将培养基的pH调节到5.4至6.0。

4.培养基的分装

培养基要趁热分装，一般以占培养容器的1/4～1/5为宜。每人配5瓶。分装后要拧紧瓶盖。

5.培养基的灭菌

培养基富含营养物质，极易引起微生物滋生而发生污染，导致培养材料死亡。因此，培养基煮制分装后，须在高温高压（121℃时保持15-20min）的条件下进行彻底的灭菌处理，杀灭所有的微生物（特别是细菌的芽孢和真菌孢子）后，才能用于植物材料的接种培养。

待培养基凝固后，放到培养室中预培养3～4d，若没有杂菌污染则可使用。

实验结果

1、一周后观察，大部分培养基已经固化，但仍有部分培养基没有固化，仍然呈液体状，转动无菌瓶可看到培养基的流动。

2、有一部分培养基被细菌、真菌污染。

3、自己制备的100%被真菌感染。

实验分析与总结

实验过程分析

1、药品称量，定规定局。钥匙、玻璃棒等专用移取工具与所去药品一一对应，避免产生交叉感染。称取过程，保持随时、随地记录（药品名称、质量等）。定容过程，同样需要注意交叉感染的现象产生。

2、“调节ph”是无菌培养基配制的基本原则之一。根据不同的培养基目的选择不同的ph值。本次培养基ph=5.6.配制恰当。

3、培养基配制均匀。配制好的培养基要摇匀后趁热分装。有的同学的培养基有的凝固了，而有的却没有凝固，因而没有摇匀分装也可能是造成这种结果的原因之一。分装，以培养容器的1/4～1/5为宜。多则浪费，少则营养不足。

4、“无菌操作”同样是无菌培养基配制的基本原则之一。操作箱、错做过程都需要严格进行。培养基分装后，广口瓶的盖子一定要旋紧，旋紧之前还应该用酒精灯消毒。

5、培养基是否无菌的判断：观察培养基里面是否有颜色变化，如果成红色或者黑色则可能被污染。

总 结

“无菌操作，目标明确，营养协调，ph适宜”是培养基配制的基本原则。本次实验因手法不熟练，操作频繁，以及实验器材灭菌不完全，使得所配置的无菌草莓培养基全部收到感染。感性上说是没有达到目的而伤心。理性上而言，此次试验失败。但“失败是成功之母”，从本次试验中我认识到也基本掌握了无菌培养基配制的基本操作方法与步奏。失败了，不气馁，总结经验，下次继续努力。

胡萝卜组织培养过程中进行无菌操作的步骤

超净工作台是进行实验的场所。酒精擦手是为了杀灭手上的病菌。无菌水冲洗是为了冲掉外植体外部的灰尘、泥土等。次氯酸冲洗是为了给外植体杀菌。无菌滤纸是为了吸干外植体外面带的水分。培养基灭菌是为了不让培养基长菌。
自采水是自己制备或生产的水。可能较为纯净，但不一定无菌。

临床意义

其重要的临床意义在于：

1、鉴别细菌

2、选择药物

3、与致病性有关：革兰氏阳性菌能产生外毒素，革兰氏阴性菌能产生内毒素，两者的致病作用不同。

Answer 2

原理：
通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经番红等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。
意义：
通过革兰氏染色分清是革兰氏阳性菌还是革兰氏阴性菌对临床用药有指导作用，比如青霉素对革兰氏阴性菌就不起作用，因为菌细胞壁结构中没有五肽交联桥。