Question

PCR的原理是什么

Answer 1

聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究 的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研 究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用PCR几小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。

PCR技术简史
PCR的最早设想 核酸研究已有100多年的历史，本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。
PCR的实现 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给 DNA的体外合成提供以致一种合适的条件---摸板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间。
PCR的改进与完善 Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的 Klenow片段，其缺点是：①Klenow酶不耐高温，90℃会变性失活，每次循环都要重新加。②引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之 间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于 Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得 PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶具有以下特点：①耐高温，在70℃下反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93℃下反应2h后其残留活性是原来的 60%，在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40%。②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增片段特异性和扩增效 率，增加了扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶I Klenow片段区别，将此酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的发现使PCR广泛的被应用。

PCR技术基本原理
PCR技术的基本原理 类似于DNA的 天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加 热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引 物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
PCR的反应动力学 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%， 但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进 入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情 况下，平台期的到来是不可避免的。
PCR扩增产物 可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5’端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所 结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3’端开始延伸，其5’端是固定的，3’端则没 有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结合 时，由于新链模板的5’端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3’端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的 “短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计， 这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。

PCR反应体系与反应条件
标准的PCR反应体系：
10×扩增缓冲液 10ul
4种dNTP混合物 各200umol/L
引物 各10～100pmol
模板DNA 0.1～2ug
Taq DNA聚合酶 2.5u
Mg2+ 1.5mmol/L
加双或三蒸水至 100ul
PCR反应五要素： 参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
引物： 引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则：
①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。
②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。

引物量： 每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
酶及其浓度 目前有两种Taq DNA聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
dNTP的质量与浓度 dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装， -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。
模板(靶基因)核酸 模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。 SDS的主要功能是： 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀 核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接 用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。
Mg2+浓度 Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。
PCR反应条件的选择
PCR反应条件为温度、时间和循环次数。
温度与时间的设置： 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法， 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。
①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则 需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。
②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长 度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：
Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)
复性温度=Tm值-(5～10℃)
在Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。
③延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：
70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子
70℃ 60核苷酸/S/酶分子
55℃ 24核苷酸/S/酶分子
高于90℃时， DNA合成几乎不能进行。

PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够 的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。
循环次数 循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。

PCR反应特点
特异性强 PCR反应的特异性决定因素为：
①引物与模板DNA特异正确的结合；
②碱基配对原则；
③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；
④靶基因的特异性与保守性。
其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。
灵敏度高 PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12g)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=10-6g)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌。
简便、快速 PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。
对标本的纯度要求低 不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。 PCR扩增产物分析
PCR产物是否为特异性扩增 ，其结果是否准确可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出正确的结论。PCR产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。
凝胶电泳分析：PCR产物电泳，EB溴乙锭染色紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。PCR产物片段的大小应与预计的一致，特别是多重PCR，应用多对引物，其产物片断都应符合预讦的大小，这是起码条件。
琼脂糖凝胶电泳： 通常应用1～2%的琼脂糖凝胶，供检测用。
聚丙烯酰胺凝胶电泳：6～10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中，可用于科研及检测分析。
酶切分析：根据PCR产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶切、电泳分离后，获得符合理论的片段，此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。
分子杂交：分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据，也是检测PCR 产物碱基突变的有效方法。
Southern印迹杂交： 在两引物之间另合成一条寡核苷酸链(内部寡核苷酸)标记后做探针，与PCR产物杂交。此法既可作特异性鉴定，又可以提高检测PCR产物的灵敏度，还可知其分子量及条带形状，主要用于科研。
斑点杂交： 将PCR产物点在硝酸纤维素膜或尼膜薄膜上，再用内部寡核苷酸探针杂交，观察有无着色斑点，主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析。

Answer 2

聚合酶链反应（PCR）的基本原理是一种酶促合成反应。即在模板DNA、引物和脱氧核糖核苷酸存在下，在DNA聚合酶的作用下，使DNA链扩增延伸。

试验先通过加热变性，使DNA双螺旋的氢链断裂，解离成单链DNA；然后通过退火，突然降温使引物与其互补的模板在局部形成杂交链；然后再在DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸底物和镁离子存在的条件下，在聚合酶催化下，以引物为起始点，使DNA链延伸。

扩展资料：

PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。

反应特点：

• 特异性强；

• 灵敏度高；

• 简便、快速；

• 纯度要求低。

参考资料：

叶顺章. 聚合酶链反应在性病诊断中的应用[J]. 中华皮肤科杂志, 1996(3):147-148.

百度百科-聚合酶链式反应

Answer 3

PCR的原理：

该技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3´-OH末端，并以此为起始点，沿模板5´→3´方向延伸，合成一条新的DNA互补链。

拓展资料：

聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。因此，无论是化石中的古生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能分离出一丁点的DNA，就能用PCR加以放大，进行比对。这也是“微量证据”的威力之所在。

参考资料：聚合酶链式反应_百度百科

Answer 4

PCR技术必须有人工合成的合理引物和提取的样品DNA,然后才进行自动热循环,最后进行产物鉴定与分析.引物设计与合成目前只能在少数技术力量较强的研究院、所进行,临床应用只需购买PCR检测试剂盒就可开展工作,PCR自动热循环中影响因素很多,对不同的DNA样品,PCR反应中各种成份加入量和温度循环参数均不一致.现将几种主要影响因素介绍如下.
　　一、温度循环参数
　　在PCR自动热循环中,最关键的因素是变性与退火的温度.如操作范例所示,其变性、退火、延伸的条件是：94℃60s, 37℃60s, 72℃120s,共25～30个循环,扩增片段500bp.在这里,每一步的时间应从反应混合液达到所要求的温度后开始计算.在自动热循环仪内由混合液原温度变至所要求温度的时间需要30～60s,这一迟滞时间的长短取决于几个因素,包括反应管类型、壁厚、反应混合液体积、热源（水浴或加热块）以及两步骤间的温度差,在设置热循环时应充分给以重视和考虑,对每一仪器均应进行实测.
　　关于热循环时间的另一个重要考虑是两条引物之间的距离；距离越远,合成靶序列全长所需的时间也越长,前文给出的反应时间是按最适于合成长度500bp的靶序列拟定的.下面就各种温度的选择作一介绍.
　　1．模板变性温度变性温度是决定PCR反应中双链DNA解链的温度,达不到变性温度就不会产生单链DNA模板,PCR也就不会启动.变性温度低则变性不完全,DNA双链会很快复性,因而减少产量.一般取90～95℃.样品一旦到达此温度宜迅速冷却到退火温度.DNA变性只需要几秒种,时间过久没有必要；反之,在高温时间应尽量缩短,以保持Taq DNA聚合酶的活力,加入Taq DNA聚合酶后最高变性温度不宜超过95℃.
　　2．引物退火温度退火温度决定PCR特异性与产量；温度高特异性强,但过高则引物不能与模板牢固结合,DNA扩增效率下降；温度低产量高,但过低可造成引物与模板错配,非特异性产物增加.一般先由37℃反应条件开始,设置一系列对照反应,以确定某一特定反应的最适退火温度.也可根据引物的（G+C）%含量进行推测,把握试验的起始点,一般试验中退火温度Ta(annealing temperature)比扩增引物的融解温度TTm(melting temperature)低5℃,可按公式进行计算：
Ta = Tm - 5℃= 4(G+C)+ 2(A+T) -5℃
　　其中A,T,G,C分别表示相应碱基的个数.例如,20个碱基的引物,如果（G+C）%含量为50%时,则Ta的起点可设在55℃.在典型的引物浓度时（如0.2μmol/L）,退火反应数秒即可完成,长时间退火没有必要.
　　3．引物延伸温度温度的选择取决于Taq DNA聚合酶的最适温度.一般取70～75℃,在72℃时酶催化核苷酸的标准速率可达35～100个核苷酸/秒.每分钟可延伸1kb的长度,其速度取决于缓冲溶液的组成、pH值、盐浓度与DNA模板的性质.扩增片段如短于150bp,则可省略延伸这一步,而成为双温循环,因Taq DNA聚合酶在退火温度下足以完成短序列的合成.对于100～300bp之间的短序列片段,采用快速、简便的双温循环是行之有效的.此时,引物延伸温度与退火温度相同.对于1kb以上的DNA片段,可根据片段长度将延伸时间控制在1～7min,与此同时,在PCR缓冲液中需加入明胶或BSA试剂,使Taq DNA聚合酶在长时间内保持良好的活性与稳定性；15%～20%的甘油有助于扩增2.5kb左右或较长DNA片段.
　　4．循环次数常规PCR一般为25～40个周期.一般的错误是循环次数过多,非特异性背景严重,复杂度增加.当然循环反应的次数太少,则产率偏低.所以,在保证产物得率前提下,应尽量减少循环次数.
　　扩增结束后,样品冷却并置4℃保存.
　　二、引物引物设计
　　要扩增模板DNA,首先要设计两条寡核苷酸引物,所谓引物,实际上就是两段与待扩增靶DNA序列互补的寡核苷酸片段,两引物间距离决定扩增片段的长度,两引物的5’端决定扩增产物的两个5’末端位置.由此可见,引物是决定PCR扩增片段长度、位置和结果的关键,引物设计也就更为重要.
　　引物设计的必要条件是与引物互补的靶DNA序列必须是已知的,两引物之间的序列未必清楚,这两段已知序列一般为15～20个碱基,可以用DNA合成仪合成与其对应互补的二条引物,除此之外,引物设计一般遵循的原则包括：
　　1．引物长度根据统计学计算,长约17个碱基的寡核苷酸序列在人的基因组中可能出现的机率的为1次.因此,引物长度一般最低不少于16个核苷酸,而最高不超过30个核苷酸,最佳长度为20～24个核苷酸.这样短的寡核苷酸在聚合反应温度（通过72℃）下不会形成稳定的杂合体.有时可在5’端添加不与模板互补的序列,如限制性酶切位点或启动因子等,以完成基因克隆和其他特殊需要；引物5’端生物素标记或荧光标记可用于微生物检测等各种目的.
　　有时引物不起作用,理由不明,可移动位置来解决.
　　2．（G+C）%含量引物的组成应均匀,尽量避免含有相同的碱基多聚体.两个引物中（G+C）%含量应尽量相似,在已知扩增片段（G+C）%含量时宜接近于待扩增片段,一般以40%～60%为佳.
　　3．引物内部应避免内部形成明显的次级结构,尤其是发夹结构（hairpin structures）.例如：
　　4．引物之间两个引物之间不应发生互补,特别是在引物3’端,即使无法避免,其3’端互补碱基也不应大于2个碱基,否则易生成“引物二聚体”或“引物二倍体”（Primer dimer）.所谓引物二聚体实质上是在DNA聚合酶作用下,一条引物在另一条引物序列上进行延伸所形成的与二条引物长度相近的双链DNA片段,是PCR常见的副产品,有时甚至成为主要产物.
　　另外,两条引物之间避免有同源序列,尤为连续6个以上相同碱基的寡核苷酸片段,否则两条引物会相互竞争模板的同一位点；同样,引物与待扩增靶DNA或样品DNA的其它序列也不能存在6个以上碱基的同源序列.否则,引物就会与其它位点结合,使特异扩增减少,非特异扩增增加.
　　5．引物3’端配对DNA聚合酶是在引物3’端添加单核苷酸,所以,引物3’端5～6个碱基与靶DNA的配对要求必须精确和严格,这样才能保证PCR有效扩增.
　　引物设计是否合理可用PCRDESN软件和美国PRIMER软件进行计算机检索来核定.
　　人工合成的寡核苷酸引于最好经过色谱（层析）纯化或PAGE纯化,以除去未能合成至全长的短链等杂质.纯化引物在25%乙腈溶液中4℃保存可阻止微生物的生长；一般情况下,不用的引物应保存在-20℃冰箱中,在液体中引物能保存6个月,冻干后可保存1～2年.

Answer 5

聚合酶链式反应（英文：Polymerase chain reaction，缩写：PCR），是一种分子生物学技术，用于扩增特定的DNA片段，这种方法可在生物体外进行，不必依赖大肠杆菌或酵母菌等生物体。

这种方法由凯利·穆利斯（Kary Mullis）于1983年开发，当时他是Cetus公司的雇员，也是1993年诺贝尔化学奖的获得者，它是一种简单，廉价和可靠的方法复制DNA片段，这个概念适用于现代生物学和相关科学的许多领域。 PCR可能是分子生物学中使用最广泛的技术。这种技术被用于生物医学研究，犯罪取证和分子考古学 。

拓展资料：

微生物复制是一个费时耗力的流程，首先要将DNA经限制酶剪裁，再利用连接酶（Ligase）加到载体（Vector）中，之后利用瞬间电击（Electroporation）或是热休克（Heat Shock）的方式，送到大肠杆菌感受态细胞（competent cell）中，将此菌于培养皿大量繁殖培养，再经过繁复的分离、纯化过程，时间通常需要近一周，才能大量复制片段。

所以仅需一小时的PCR能节省大量时间和繁复的操作，聚合酶链式反应技术被广泛地运用在医学和生物学的实验室，例如用于判断检体中是否会表现某遗传疾病的图谱、传染病的诊断、基因复制，以及亲子鉴定。