Question

求教关于野生菌转化及PCR方面的问题

各位大虾，小弟的课题是有关于一种野生菌的转化，该菌的启动子，SD序列等可在E.coli中正常表达蛋白，因此小弟选用pUC19,pBR322两种最普通的E.coli质粒进行转化，转化方法参照分子克隆上的E.coli氯化钙转化法，每次平均加入的质粒量为500ng-1ug，转化后平板上长出的克隆最多也就10个左右（做了相关菌体特征性验证，证明是我的目的菌落，不是杂菌），且有些为抗性菌（操作还没过关，见谅）。提取质粒电泳后在3000-5000bp内有条带，比marker稍暗，但清晰可见，但是每次双酶切后要么没有条带，要么没切开，虽然存在可能性（比如正好有个其他的杂菌，带有差不多大小的质粒，然后污染了，然后结合转化到了目的菌里，但这好像概率也实在太低了，而且我做了3次都出现了同样的情况），但还是百思不得其解，求教各位大虾，有没有遇到过类似的情况。。。。。。

PS：另外求教PCR大大们，小弟本想通过设计引物PCR扩增抗生素基因的方法来进行侧面验证（考虑到野生菌内有各种酶可能会对转化后的质粒造成影响，如甲基化等等导致酶切失败），但设计针对pUC19的Amp抗生素引物时无法扩增出相应的抗生素基因，电泳条带清一色的全都是引物二聚体，用olige软件设计时并未出现匹配度方面的问题，只是在引物二聚体的能量方面稍有超过，但软件并未提示出错，求教原因。。。。。。

附上引物序列pUC19 Amp抗性基因，860bp，位于全序列1626-2486，引物：上游TTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCT 下游ATGAGTATTCAACATTTCCGTG

Answer 1

pUC19上面有些通用引物可以试一下，新的引物不能肯定会成功。把质粒提出来做PCR，而不是用菌落做。质粒一般来说是很容易出结果的。
有时候提的质粒质量不过关或者量太小，酶切就看不见是正常的。切没切开，有时候要与未切过的一起跑得试一试，直观的有时候看不出来

Answer 2

不太懂你的意思。。

首先，这两个质粒不能表达呀，只是克隆用的。你是用这两个质粒转化到你的野生菌里边？为了什么目的？

提取质粒后电泳比marker暗，你用的多少marker啊？市面上卖的一般最亮的一条是50ng的，一般用质粒小提试剂盒提出来的2-3ul都比这个亮吧。所以你确定是转进去了吗？

amp的话不会致死，过个两天一般就失效了，你的野生菌长多久会形成菌落呀？

感觉污染也是有可能的，实在不行就挑一个测个序，看到底是不是你要的东西。

追问

我用pUC19载入的目的基因里带有启动子，等于是一个表达载体，转进去之后检测结果没有表达，在E.coli里确定有表达。。。

追答

是不是污染呢？

感受态细胞污染，做转化的时候污染都是有可能的

追问

这也太巧了吧，因为我验证过，菌是我的菌种，不是杂菌，里面很明显有质粒条带，但不是我的目的质粒。。。PCR没结果，对照的pUC19质粒PCR有条带。。。哭死。。。这是什么东西啊，如果转化到野生菌后，质粒被甲基化修饰了，那PCR还能扩增出目的条带吗？

追答

“里面很明显有质粒条带，但不是我的目的质粒。。。”这个估计就是转化时污染了，
实验室可能做实验做多了，就好很多其他质粒在空气中形成气溶胶。

甲基化修饰不影响PCR扩增，所以P不出来估计就是不对的质粒。