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实验三 叶绿体色素的提取分离与理化性质鉴定
一、实验目的
1、学会叶绿体色素提取和分离的方法。
2、了解叶绿体色素的荧光现象、皂化反应等理化性质。
二、实验原理
叶绿体中含有绿色素(包括叶绿素a和叶绿素b)和黄色素(包括胡萝卜素和叶黄素)两大类,这两类色素都不溶于水,而溶于有机溶剂,故可用乙醇或丙酮等有机溶剂提取。
提取液可用色层分析的原理加以分离。因吸附剂对不同物质的吸附力不同,当用适当的溶剂推动时,混合物中各成分在两相(流动相和固定相)间具有不同的分配系数,所以它们的移动速度不同,经过一定时间层析后,便将混合色素分离。
叶绿素是一种二羧酸——叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯,故可与碱起皂化反应而生成醇(甲醇和叶绿醇)和叶绿酸的盐,产生的盐能溶于水中,可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开;叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性,叶绿素吸收光量子而转变成激发态,激发态的叶绿素分子很不稳定,当它变回到基态时可发射出红光量子,因而产生荧光。叶绿素中的镁可以被H+所取代而成褐色的去镁叶绿素,后者遇铜则成为绿色的铜代叶绿素,铜代叶绿素很稳定,在光下不易破坏,故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。
三、实验器材
新鲜的植物叶片。
研钵;漏斗;100ml三角瓶;玻璃棒;剪刀;滴管;培养皿;定性滤纸条(5cm×1.5cm)。
毛细管;试管;试管架;石棉网;烧杯(100ml);酒精灯;铁三角架;刻度吸量管2ml、5ml各1支。
四、实验试剂
1、95%乙醇;石英砂;碳酸钙粉
2、推动剂:按石油醚:丙酮:苯(10:2:1)比例配制(体积比)
3、醋酸铜粉末;5%的稀盐酸
4、甲醇、KOH
五、实验步骤
1.叶绿体色素的提取
(1)取菠菜或其他植物新鲜叶片4~5片(2g左右),洗净,擦干,去掉中脉,剪碎,放入研钵中。
(2)研钵中加入少量石英砂及碳酸钙粉,加2~3ml 95%乙醇,研磨至糊状,再加10ml 95%乙醇,暗处放置3~5min,上清液过滤于三角瓶中,残渣用10ml 95%乙醇冲洗,一同过滤于三角瓶中。
2. 叶绿体色素的分离
(1)取一块预先干燥处理过的定性滤纸,将它剪成长约10cm ,宽约1cm的滤纸条。
(2)用毛细管吸取色素提取液。在滤纸条的一端(约距这一端的1cm处)划出一条滤液细线,等滤液干燥后,再重复划4~5次。
(3)将滤纸条的另一端(约距这一端1cm处)折成“V”字形,并将它挂在放有层析液的烧杯壁上(注意:色素线要略高于层析液面,且滤纸条下端最好不要碰到烧杯壁),盖上培养皿。
3.叶绿体色素的性质鉴定
(1)荧光现象的观察
取1支20ml刻度试管加入5ml叶绿体色素乙醇提取液,在直射光下观察溶液的透射光与反射光颜色有何不同?解释原因。
(2)皂化作用(绿色素与黄色素的分离)
在做过荧光现象观察的叶绿体色素乙醇提取液试管中加入1.5ml 20%KOH-甲醇溶液,充分摇匀。片刻后,加入5ml苯,摇匀,再沿试管壁慢慢加入1~1.5ml蒸馏水,轻轻混匀(勿激烈摇荡),于试管架上静置分层。若溶液不分层,则用滴管吸取蒸馏水,沿管壁滴加,边滴加边摇动,直到溶液开始分层时,静置。可以看到溶液逐渐分为两层,下层是稀的乙醇溶液,其中溶有皂化的叶绿素a和b(以及少量的叶黄素);上层是苯溶液,其中溶有黄色的胡萝卜素和叶黄素。
(3)H+和Cu++对叶绿素分子中Mg++的取代作用
取上述色素乙醇提取液少许于试管中,加入5%HCl数滴,摇匀,直至溶液出现褐绿色,当溶液变褐后,再加入少量醋酸铜粉末,微微加热,观察记载溶液颜色变化情况。
六、注意事项
1、为了避免叶绿素的光分解,操作应在弱光下进行。
2、研磨时间尽可能短些,以不超过两分钟为宜。
3、在低温下发生皂化反应的叶绿体色素溶液,易乳化而出现白絮状物,溶液浑浊,且不分层。可激烈摇匀,放在30~40℃的水浴中加热,溶液很快分层,絮状物消失,溶液变得清澈透明。
七、实验报告
1、将纸层析法分离叶绿体色素的实验结果贴在实验报告纸上,并给予分析。
《你看着少抄点》
一、实验目的
1、学会叶绿体色素提取和分离的方法。
2、了解叶绿体色素的荧光现象、皂化反应等理化性质。
二、实验原理
叶绿体中含有绿色素(包括叶绿素a和叶绿素b)和黄色素(包括胡萝卜素和叶黄素)两大类,这两类色素都不溶于水,而溶于有机溶剂,故可用乙醇或丙酮等有机溶剂提取。
提取液可用色层分析的原理加以分离。因吸附剂对不同物质的吸附力不同,当用适当的溶剂推动时,混合物中各成分在两相(流动相和固定相)间具有不同的分配系数,所以它们的移动速度不同,经过一定时间层析后,便将混合色素分离。
叶绿素是一种二羧酸——叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯,故可与碱起皂化反应而生成醇(甲醇和叶绿醇)和叶绿酸的盐,产生的盐能溶于水中,可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开;叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性,叶绿素吸收光量子而转变成激发态,激发态的叶绿素分子很不稳定,当它变回到基态时可发射出红光量子,因而产生荧光。叶绿素中的镁可以被H+所取代而成褐色的去镁叶绿素,后者遇铜则成为绿色的铜代叶绿素,铜代叶绿素很稳定,在光下不易破坏,故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。
三、实验器材
新鲜的植物叶片。
研钵;漏斗;100ml三角瓶;玻璃棒;剪刀;滴管;培养皿;定性滤纸条(5cm×1.5cm)。
毛细管;试管;试管架;石棉网;烧杯(100ml);酒精灯;铁三角架;刻度吸量管2ml、5ml各1支。
四、实验试剂
1、95%乙醇;石英砂;碳酸钙粉
2、推动剂:按石油醚:丙酮:苯(10:2:1)比例配制(体积比)
3、醋酸铜粉末;5%的稀盐酸
4、甲醇、KOH
五、实验步骤
1.叶绿体色素的提取
(1)取菠菜或其他植物新鲜叶片4~5片(2g左右),洗净,擦干,去掉中脉,剪碎,放入研钵中。
(2)研钵中加入少量石英砂及碳酸钙粉,加2~3ml 95%乙醇,研磨至糊状,再加10ml 95%乙醇,暗处放置3~5min,上清液过滤于三角瓶中,残渣用10ml 95%乙醇冲洗,一同过滤于三角瓶中。
2. 叶绿体色素的分离
(1)取一块预先干燥处理过的定性滤纸,将它剪成长约10cm ,宽约1cm的滤纸条。
(2)用毛细管吸取色素提取液。在滤纸条的一端(约距这一端的1cm处)划出一条滤液细线,等滤液干燥后,再重复划4~5次。
(3)将滤纸条的另一端(约距这一端1cm处)折成“V”字形,并将它挂在放有层析液的烧杯壁上(注意:色素线要略高于层析液面,且滤纸条下端最好不要碰到烧杯壁),盖上培养皿。
3.叶绿体色素的性质鉴定
(1)荧光现象的观察
取1支20ml刻度试管加入5ml叶绿体色素乙醇提取液,在直射光下观察溶液的透射光与反射光颜色有何不同?解释原因。
(2)皂化作用(绿色素与黄色素的分离)
在做过荧光现象观察的叶绿体色素乙醇提取液试管中加入1.5ml 20%KOH-甲醇溶液,充分摇匀。片刻后,加入5ml苯,摇匀,再沿试管壁慢慢加入1~1.5ml蒸馏水,轻轻混匀(勿激烈摇荡),于试管架上静置分层。若溶液不分层,则用滴管吸取蒸馏水,沿管壁滴加,边滴加边摇动,直到溶液开始分层时,静置。可以看到溶液逐渐分为两层,下层是稀的乙醇溶液,其中溶有皂化的叶绿素a和b(以及少量的叶黄素);上层是苯溶液,其中溶有黄色的胡萝卜素和叶黄素。
(3)H+和Cu++对叶绿素分子中Mg++的取代作用
取上述色素乙醇提取液少许于试管中,加入5%HCl数滴,摇匀,直至溶液出现褐绿色,当溶液变褐后,再加入少量醋酸铜粉末,微微加热,观察记载溶液颜色变化情况。
六、注意事项
1、为了避免叶绿素的光分解,操作应在弱光下进行。
2、研磨时间尽可能短些,以不超过两分钟为宜。
3、在低温下发生皂化反应的叶绿体色素溶液,易乳化而出现白絮状物,溶液浑浊,且不分层。可激烈摇匀,放在30~40℃的水浴中加热,溶液很快分层,絮状物消失,溶液变得清澈透明。
七、实验报告
1、将纸层析法分离叶绿体色素的实验结果贴在实验报告纸上,并给予分析。
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参考资料: 百度文库
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