Question

PCR产物直接测序的原理

Answer 1

原理：
是来至于双脱氧链终止法——现在应用最多的核酸测序技术，由Sanger等1977年提出：
模板经过测序PCR反应后形成3'末端带有荧光标记（早期用同位素标记）的相差一个碱基的不同长度的产物，再根据每段DNA产物的电泳速度来检测整段DNA的序列。

以上——手打——希望对你有帮助

优点：
一是操作易于标准化与自动化，因为它是一个单一的酶的反应过程，不依赖于生物体；
二是通过一次测序反应就能确定样品中某个等位基因的顺序，而PCR产物克隆后测序时，样品顺序要在测定了数个克隆片段之后才能确定。因为只有这样，才能区别突变是基因组本来就有的，还是由于Tag聚合酶在PCR过程中错误掺入核苷酸引起的。

追问

那麻烦了，我还想知道一下，为什么测序结果中前后100bp的序列不可信，即为什么测序信号不好？这是怎么造成呢？

追答

PCR产物直接进行测序，在PCR产物长度以后将无反应信号，机器将产生许多N值。

通常我们很容易辨别PCR产物结束的位点，PCR产物测序一般末端的一个碱基为A（绿色峰），这是由于Taq酶能够在PCR反应的末端非特异性地加上一个A碱基，我们用T载体克隆PCR产物就是根据该原理的。在最后一个碱基A后，信号会迅速减弱。

因此我们要根据序列正确判断出PCR产物的末端序列，在此序列以外就不是我们所要的序列了。 在序列的起始端有时会有一些N值。该种情况主要是有未去除的染料单体造成的干扰峰。该干扰峰和正常序列峰重叠在一起，有时机器将无法正确判断出为何碱基。有时，在序列的起始端的小片段容易丢失，导致起始区信号过低，机器有时也无法正确判读。
还有，提供的PCR引物用于测序时，有时会产生引物二聚体，对测序的起始区造成干扰，在序列的3’端容易产生N值。

Answer 2

PCR产物测序原理也是基于双脱氧核糖核苷终止法。只不过测序用的引物就是你自己做PCR时的引物。用PCR产物直接测序缺陷是两端靠近引物的序列容易测不准，因此想获得PCR产物全序列测序的话还是要链接到载体上测序为好。

Answer 3

目前常用的方法是连到T载体上这样可以用通用引物。如果直接测序的话（最少得纯化一下，脱盐等），可以用你自己的引物（做PCR时用的）。

Answer 4

没法直接测序吧 怎么也得连个T载体才能测啊