Question

求助分子生物学问题

1、RNA提取分离纯化时应注意什么？
2、真核基因克隆的基本过程及其注意事项。
3、真核基因扩增时出现非特异性条带的原因及解决方法。
4、基因原核与真核表达的过程及其产物有何不同。
5、分别设计一对基因（用于表达）的引物。
1 gtgaaaagta ccagcgatct gttcaatgaa attattccat tgggtcgctt aatccatatg
61 gttaatcaga agaaagatcg cctgcttaac gagtatctgt ctccgctgga tattaccgcg
121 gcacagttta aggtgctctg ctctatccgc tgcgcggcgt gtattactcc ggttgaactg
181 aaaaaggtat tgtcggtcga cctgggagca ctgacccgta tgctggatcg cctggtctgt
241 aaaggctggg tggaaaggtt gccgaacccg aatgacaagc gcggcgtact ggtaaaactt
301 accaccggcg gcgcggcaat atgtgaacaa tgccatcaat tagttggcca ggacctgcac
361 caagaattaa caaaaaacct gacggcggac gaagtggcaa cacttgagta tttgcttaag
421 aaagtcctgc cgtaa

Answer 1

1RNA为单链，其结构不稳定，较易变性，故提取时应注意。
2（1)提取真核生物DNA用鸟枪法获得其目标DNA，
（2）用相同的DNA内切酶处理大肠杆菌质粒。
（3）将目的DNA与大肠杆菌质粒在DNA连接酶种处理，使得两者结合。
4真核生物其mRNA形成需要加工，真核生物先形成hnRNA，经过加工后形成mRNA，儿原核生物则没有加工过程。
5
你可以用DNAMAN这个软件帮助设计，将你所要的碱基顺序输入，在用其PCR引物设计，就可以了。

Answer 2

1.周围环境中的RNase相当多，而且很难降解，就算高温高压灭菌也不一定能清除干净，因此分离纯化RNA时使用的枪头，离心管都必须是RNase free的，如果没有，就要自己用DEPC处理以后再使用，最好使用的枪也是单独一套不要跟提取DNA的枪混用以防止RNase污染，切记不能裸手触摸枪头、离心管等物品。
2.看你要克隆什么区域了，如果是ORF区，最好从cDNA文库里扩增，片段如果比较大，一定要选用品质好一点的高保真酶，扩增循环数不用太多，以防止出现突变。如果是其他区域要抽提genomic DNA，但是扩增以后要用切胶回收，以防止genomic DNA污染。
3.如果出现非特异条带可以提高退火温度试一试，一般出现这个情况有可能是设计引物的问题，模板不好也有可能
4.原核表达一般用于比较简单的不需要复杂加工的蛋白，因为原核表达系统里没有这些加工元件，而真核表达系统多用于表达有复杂结构或比较大的蛋白
5.你这个问题太不专业了，你要扩增多大的序列用于表达，用什么载体？什么酶切位点？这些都是设计引物所必须考虑的

Answer 3

3.出现非特异条带的原因有:1.引物错误(序列较短 引物内部或引物间有互补序列)2.复性温度太低
解决方法:1.重新设计引物2.摸索最佳复性条件