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根据酶的功能特性、大小及反应时所需的辅助因子,限制性内切酶可分为两大类,即I类酶和II酶。最早从大肠杆菌中发现的EcoK、EcoB就属于I类酶。其分子量较大;反应过程中除需Mg2+外,还需要S-腺苷-L甲硫氨酸、ATP;在DNA分子上没有特异性的酶解片断,这是I、II类酶之间最明显的差异。因此,I类酶作为DNA的分析工具价值不大。II类酶有EcoR I、BamH I、Hind II、Hind III等。其分子量小于105道尔顿;反应只需Mg2+;最重要的是在所识别的特定碱基顺序上有特异性的切点,因而DNA分子经过II类酶作用后,可产生特异性的酶解片断,这些片断可用凝胶电泳法进行分离、鉴别。 限制性内切酶识别DNA序列中的回文序列。有些酶的切割位点在回文的一侧(如EcoR I、BamH I、Hind等),因而可形成粘性末端,另一些II类酶如Alu I、BsuR I、Bal I、Hal III、HPa I、Sma I等,切割位点在回文序列中间,形成平整末端。Alu I的切割位点如下: 5'-A G^C T-3' 3'-T C^G A-5' 在已发现的限制性内切酶中,近百种酶的识别顺序已被测定。有很多来源不同的酶有相同的碱基识别顺序,这种酶称为“异源同功酶”(isochizomer,同切限制内切酶;同裂酶)。应该注意的是,这些酶虽然有相同的识别顺序,但它们的切点并不完全一样。例如Xma I和Sma I都识别六核苷酸CCCGGG,但Xma I的切点在cCCGGG,而Ema I的切点则在CCCGgGG,前者切割DNA分子,形成带有CCGG粘性末端的DNA片段,而后者并不形成粘性末端。当然,也有识别顺序和切点都相同的酶,如Hap II、Hpa II、Mno I,都在识别顺序CCGG内有一相同的切点,Hal III和BsuR I同样在识别顺序GGCC内有一相同的切点。
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