【文献分享】烟草花冠细胞单细胞
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目前植物的单细胞相关的文章大多集中在模式植物,例如拟南芥和水稻等。而研究组织叶大多集中在叶片和根。下面这个可能是我看到的第一篇关于烟草单细胞研究相关的文章,研究的是花冠细胞。
2022年1月,new phytologist在线发表了韩国sang-gyu kim团队题为“
Single-cell RNA-sequencing of Nicotianaattenuata corolla cells reveals the biosynthetic pathway of a floral scent ” 的研究论文。 该研究通过绘制烟草花冠细胞的单细胞转录图谱,鉴定了3765个花冠细胞,通过比较不同基因在3765个细胞之间的表达模式,鉴定了合成benzylacetone(BA)通路上的关键基因:NaPAL4, Na4CL, NaPKS2/3, NaAFR。同时验证的BA主要在花冠细胞的epidermal layer合成 ,为理解烟草BA的合成和调控规律提供了新的认知。
在这个研究中,作者选取单细胞测序的样品是:corolla limbs和throat cups(下图a)。然后选了三个时间点:ZT8,ZT12, ZT16。通过单细胞测序一共获得了3756个cell,其中从附表数据给出的几个参数来看:Median genes per cell (大约1000),Reads map to genome(30%左右),个人觉得就单细胞测序数据quality是一般的。
通过UMAP结果,可以看出可以分成10个cluster(下图b),从三个不同时间点的聚类分布来看,也是差异不大的(下图c)。接下来就是对每个cluster进行注释了。文中作者指出,因为缺乏花中相关的marker gene,所以作者先de-novo获得每个cluster的marker gene,然后根据marker gene来注释每个cluster。其中主要用的marker gene是:cluster 7 (Pollen: pectin esterase genes, extension families和pollen allergens),cluster 8 (Phloem/xylem: SWEET11/12, SULTR2;1),cluster 0/3/4/5/9 (Epidermal cell:ketoacyl-CoA synthase, ECERIFERUM4, wax ester synthase/diacylglycerol acyltransferase 1, lipid-transfer protein, glycerol-3-phosphate acyltransferase 6, cutin synthase-like)(下图d),cluster 6(chlorenchyma:photosystem I/II),cluster 1/2(parenchyma cell:因为cuticle合成相关的基因比较低,但是光合作用合成的基因比较高,下图e)。
接下来,作者着重点研究了BA的合成。在花冠中,BA合成途径首先是由NaPAL4开始的(下图a)。然后接下来需要酶4CL/CNL。下面的一步有NaPKS完成(其中烟草中有4个member 1/2/3/4,但是不确认是那个member)。合成途径中除了已知的PAL4,PKS是不知道那个member,4CL和AER是不太清楚,没有验证。所以作者假设,基于已知的PAL4,合成途径上的其它基因应该在单细胞level和PAL4有很强的相关性,或者表达patter一致(这和研究基因和基因的调控一样)。
所以作者计算了单细胞测序鉴定出来的所有基因和PAL4的相关性(下图b),同时用发表的RNA-seq数据做了同步的双向验证。从结果来看,单细胞结果和RNA-seq的结果有一致的,比如高相关性的4CL1基因,以及PKS2/3,AER1。但是也有不太一致的,比如从相关性分布来看,单细胞的更集中,更符合正态分布(下图c)。还有IFR3就相差很大。
然后,作者开始分别验证获得的4CL1,PKS2/3,AER1基因在BA合成过程中的作用。
下图是4CL1敲除的结果。从VIGS敲除来看,敲除4CL1后,花冠顶部和内部4CL1的表达量明显降低(下图a/b),BA含量也都明显降低(下图a/b)。并且代谢产物的类型是cinnamic acid和coumaric acid,而不是caffeic acid和ferulic acid。另外作者也查看了在这个4CL1的敲除材料中,其它4CLmember并没有受影响。
然后,作者尝试去验证PKS2/3的功能。从PKS2/3的敲除材料中可以看出,不管是顶部还是内部BA的含量都显著降低(下图a/b)。但是由于PKS家族的高度相似性,PKS1/4在敲除材料中也有所下降。当时当作者把PKS2和PKS3分别加入4CL1的产物CINNAMOLY-CoA中后发现,只有在加入PKS2的反应物中鉴定到了BA,而PKS3中则没有鉴定到(下图c)。从而说明在这个过程中主要是PKS2这个基因起着关键的作用,并且PKS2的相关性也是远强于PKS3的。
同样的测试了AER1在BA合成过程中的功能。同样滴,在AER1的敲除材料中,在花冠顶部和内部,BA的含量都显著降低(下图a/b)。进而,在AER1的敲除植株中鉴定到了一个新的benzalacetone化合物(下图c),是BA的一种非还原形式。并且这个新的化合物在野生型的花冠顶部是不存在的(下图c)。
证明完这个4个基因在BA合成过程中的作用后( 其实个人觉得这4个基因的发现过程好像也不需要单细胞数据,貌似普通的多组织RNA-seq也能实现,毕竟这4个基因RNA-seq的结果也是包含的 ),作者开始利用单细胞数据来探索这4个基因在不同细胞中的分布规律。然后发现在3756个细胞中,1097个细胞包含这4个基因,而这1097个cell基本都集中在cluster 0/3/4(下图a)。而从4个基因在不同细胞的表达pattern也是可以明显发现主要在cluster 0/3/4富集(下图b/c)。这3个cluster已经知道是epidermal cell了,所以可以合理的假设和猜测BA可能是在花冠的epidermal cell中合成的。
GFP定位信息也说明这几个基因主要在epidermal cell中表达(下图)。
因为BA在花冠中的合成是受生物钟的调节的所以作者接下来查看了这4个关键的功能基因对于生物钟节律的调控关系。从表达pattern来看,这4个功能基因的表达是随着时间有着节律的变化(下图a),和已知的节律基因类似(下图a),同样的还有BA的含量变化(下图a)。因为单细胞取样是取了3个时间点的,包含白天和晚上的点。所以作者也查看了在单细胞数据中这4个基因的变化,也可以明显看出明显在白天12h有个peak(下图b)。然后作者测定了BA以及4个关键的合成基因在corolla limb和corolla tube中的差异,从化合含量可以看出BA主要在limb中,从表达来说,尽管PAL和4CL在tube中也有表达,但是PKS2和AERA在tube中几乎不表达,再次证明了BA的合成部位(下图c)。
2022年1月,new phytologist在线发表了韩国sang-gyu kim团队题为“
Single-cell RNA-sequencing of Nicotianaattenuata corolla cells reveals the biosynthetic pathway of a floral scent ” 的研究论文。 该研究通过绘制烟草花冠细胞的单细胞转录图谱,鉴定了3765个花冠细胞,通过比较不同基因在3765个细胞之间的表达模式,鉴定了合成benzylacetone(BA)通路上的关键基因:NaPAL4, Na4CL, NaPKS2/3, NaAFR。同时验证的BA主要在花冠细胞的epidermal layer合成 ,为理解烟草BA的合成和调控规律提供了新的认知。
在这个研究中,作者选取单细胞测序的样品是:corolla limbs和throat cups(下图a)。然后选了三个时间点:ZT8,ZT12, ZT16。通过单细胞测序一共获得了3756个cell,其中从附表数据给出的几个参数来看:Median genes per cell (大约1000),Reads map to genome(30%左右),个人觉得就单细胞测序数据quality是一般的。
通过UMAP结果,可以看出可以分成10个cluster(下图b),从三个不同时间点的聚类分布来看,也是差异不大的(下图c)。接下来就是对每个cluster进行注释了。文中作者指出,因为缺乏花中相关的marker gene,所以作者先de-novo获得每个cluster的marker gene,然后根据marker gene来注释每个cluster。其中主要用的marker gene是:cluster 7 (Pollen: pectin esterase genes, extension families和pollen allergens),cluster 8 (Phloem/xylem: SWEET11/12, SULTR2;1),cluster 0/3/4/5/9 (Epidermal cell:ketoacyl-CoA synthase, ECERIFERUM4, wax ester synthase/diacylglycerol acyltransferase 1, lipid-transfer protein, glycerol-3-phosphate acyltransferase 6, cutin synthase-like)(下图d),cluster 6(chlorenchyma:photosystem I/II),cluster 1/2(parenchyma cell:因为cuticle合成相关的基因比较低,但是光合作用合成的基因比较高,下图e)。
接下来,作者着重点研究了BA的合成。在花冠中,BA合成途径首先是由NaPAL4开始的(下图a)。然后接下来需要酶4CL/CNL。下面的一步有NaPKS完成(其中烟草中有4个member 1/2/3/4,但是不确认是那个member)。合成途径中除了已知的PAL4,PKS是不知道那个member,4CL和AER是不太清楚,没有验证。所以作者假设,基于已知的PAL4,合成途径上的其它基因应该在单细胞level和PAL4有很强的相关性,或者表达patter一致(这和研究基因和基因的调控一样)。
所以作者计算了单细胞测序鉴定出来的所有基因和PAL4的相关性(下图b),同时用发表的RNA-seq数据做了同步的双向验证。从结果来看,单细胞结果和RNA-seq的结果有一致的,比如高相关性的4CL1基因,以及PKS2/3,AER1。但是也有不太一致的,比如从相关性分布来看,单细胞的更集中,更符合正态分布(下图c)。还有IFR3就相差很大。
然后,作者开始分别验证获得的4CL1,PKS2/3,AER1基因在BA合成过程中的作用。
下图是4CL1敲除的结果。从VIGS敲除来看,敲除4CL1后,花冠顶部和内部4CL1的表达量明显降低(下图a/b),BA含量也都明显降低(下图a/b)。并且代谢产物的类型是cinnamic acid和coumaric acid,而不是caffeic acid和ferulic acid。另外作者也查看了在这个4CL1的敲除材料中,其它4CLmember并没有受影响。
然后,作者尝试去验证PKS2/3的功能。从PKS2/3的敲除材料中可以看出,不管是顶部还是内部BA的含量都显著降低(下图a/b)。但是由于PKS家族的高度相似性,PKS1/4在敲除材料中也有所下降。当时当作者把PKS2和PKS3分别加入4CL1的产物CINNAMOLY-CoA中后发现,只有在加入PKS2的反应物中鉴定到了BA,而PKS3中则没有鉴定到(下图c)。从而说明在这个过程中主要是PKS2这个基因起着关键的作用,并且PKS2的相关性也是远强于PKS3的。
同样的测试了AER1在BA合成过程中的功能。同样滴,在AER1的敲除材料中,在花冠顶部和内部,BA的含量都显著降低(下图a/b)。进而,在AER1的敲除植株中鉴定到了一个新的benzalacetone化合物(下图c),是BA的一种非还原形式。并且这个新的化合物在野生型的花冠顶部是不存在的(下图c)。
证明完这个4个基因在BA合成过程中的作用后( 其实个人觉得这4个基因的发现过程好像也不需要单细胞数据,貌似普通的多组织RNA-seq也能实现,毕竟这4个基因RNA-seq的结果也是包含的 ),作者开始利用单细胞数据来探索这4个基因在不同细胞中的分布规律。然后发现在3756个细胞中,1097个细胞包含这4个基因,而这1097个cell基本都集中在cluster 0/3/4(下图a)。而从4个基因在不同细胞的表达pattern也是可以明显发现主要在cluster 0/3/4富集(下图b/c)。这3个cluster已经知道是epidermal cell了,所以可以合理的假设和猜测BA可能是在花冠的epidermal cell中合成的。
GFP定位信息也说明这几个基因主要在epidermal cell中表达(下图)。
因为BA在花冠中的合成是受生物钟的调节的所以作者接下来查看了这4个关键的功能基因对于生物钟节律的调控关系。从表达pattern来看,这4个功能基因的表达是随着时间有着节律的变化(下图a),和已知的节律基因类似(下图a),同样的还有BA的含量变化(下图a)。因为单细胞取样是取了3个时间点的,包含白天和晚上的点。所以作者也查看了在单细胞数据中这4个基因的变化,也可以明显看出明显在白天12h有个peak(下图b)。然后作者测定了BA以及4个关键的合成基因在corolla limb和corolla tube中的差异,从化合含量可以看出BA主要在limb中,从表达来说,尽管PAL和4CL在tube中也有表达,但是PKS2和AERA在tube中几乎不表达,再次证明了BA的合成部位(下图c)。
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