Question

SDS碱裂解法制备质粒DNA的具体操作步骤是怎么样的？那位大侠给力点，帮下忙

Answer 1

我给你说下我们实验室的简易操作：
1.收菌。将菌液从试管中倒入1.5mlEP管，10000rpm/min，30s离心。离心转速不必过大时间不必过长，以免难以悬浮。必要时收两次。离心后弃上清，将残留菌液尽量扣干。
2.悬浮菌液。用200/250ul碱提Ⅰ液（确定已加入RNAse）悬浮沉淀，可在振荡器上振荡悬浮。目的是制成均一菌液。
3.蛋白质变性。加入同Ⅰ液等体积Ⅱ液，轻柔颠倒6~8次。动作一定要轻柔，以免扯断质粒。
4.中和SDS变性作用，沉淀蛋白质及基因组DNA。加入Ⅲ液，体积为Ⅰ液的1.2倍。加入后立即上下颠倒6~8次，以免局部作用。
5.除蛋白。13000rpm/min，5min离心。
6.酚氯仿抽提。将离心后上清倒入酚氯仿管中，剧烈震荡混匀，至看不出液体分层现象。（在离心过程中即可进行酚氯仿分装，400ul/管。酚氯仿有一定毒性，加入时注意将枪尖抵到EP管壁上，以免溅出腐蚀皮肤。）13000rpm/min，5min离心。
7.异丙醇沉淀DNA。将离心后上清用200ul的枪吸入异丙醇管中，共吸两次。上下颠倒6~8次。（异丙醇分装同6中酚氯仿分装操作，吸走上清的酚氯仿管也要盖上管盖扔到垃圾桶中）13000rpm/min，5min离心。
8.75%乙醇洗涤。600ul75%乙醇洗涤，将枪尖对着管口处管壁并旋转EP管进行乙醇洗涤，管口略朝下，以使乙醇立即顺势流出，注意不要将枪尖对着管底，以免冲起沉淀在底部的质粒。（此步操作需要一定技巧和熟悉度，若不便操作可选择加入500ul乙醇，13000rpm/min，2min离心，弃上清）洗涤后，将残留乙醇扣干。
9.除乙醇。在60°烘干机或抽干机上除乙醇，至靠近管口无酒精味。约5~10min。（尽量将乙醇除干净，以免影响后面的操作效率）
10.水溶。40ul超纯水溶解质粒DNA。一般也可将加入后的溶液盖上盖子在烘干机上促融2min。
11.跑胶鉴定。2ul质粒跑琼脂糖凝胶鉴定。有一条明显的条带即说明提到了。
操作中的溶液配制可参考其他网站。提质粒也是要靠经验积累才能提得好，条带就又细又亮。

Answer 2

http://www.csun.edu/~mls42367/Protocols/Alk%20Lysis%20prep.pdf