Question

为什么基因测序失败？都提纯了基因，跑了电泳有结果，测序上游引物有成功，下游引物却没有？为什么？

Answer 1

1、你测的是片段？引物是自己设计的吗？下游测不出来有可能是引物不佳。之前是否用此引物测过？
2、你的片段多长？必须双向测通吗？如果必须双向的话，不妨连接载体，比如T载体什么的，然后提质粒出来，用载体上的通用引物测，会好一些。
3、实在无法解决，可以让测序公司根据上游的测序结果自行设计引物，多测几个反应，直到测通。这样费用要高一些。

追问

是双向测通，以前没用过，如果下游引物不佳，为什么还能扩增，跑出电泳呢？如果是测序公司的原因也有可能吧？你的建议蛮好的，连接T载体。

追答

看来你是用PCR引物直接做测序引物了。虽然很多情况下的确可以通用，但是不排除有时候不能的情况...测序引物要求纯度高，而且退火温度比PCR严格些。还是用通用引物测最省事，涂板摇菌也不耽误多少时间...

追问

通用引物和自己设计的那引物测序有什么不同么？为什么不都用通用引物呢？

追答

通用引物都是经过很多次验证的，肯定能够测出来的。而PCR引物根据基因的不同，每个都不一样，仅验证了PCR能够成功，但测序并未验证过，所以成功率肯定比不上通用引物。
测序引物对Tm、GC%、长度、同源性、二级结构、纯度等指标上都比PCR引物严格，比如你的引物Tm在65度，55度退火一样能P出条带，但是测序就不行了。所以有时会出现能P出来但测不出的情况。
“为什么不都用通用引物呢”，呃，反正我们实验室测序90%都是用通用引物，自己设计引物的时候极少...能用的时候肯定用的...