Question

引物TM值和PCR程序问题

Answer 1

引物tm是设值和合成引物时的tm值,
也就是理论值。
而pcr产物tm值是在实际操作中摸索出来的温度值
引物tm值与pcr产物tm值这两个不同的引物当然退火温度也不相同,一般在设计引物的时候,程序就会显示出tm值是多少.在做pcr的时候,将退火温度设定的稍微低于tm值一点,降低引物的特异性,可能会好点.
当然,做pcr有一定的运气成分,同样的条件有时能扩出基因来,有时候却不能.一般来说,一直无法p出基因的话,首先就要检查引物设计是否有问题,如果没有问题,或者以前p出来过.那么检查下退火温度,多试几个温度.再就是mg离子的浓度,模板不要太多.多尝试一下.
总之,设定退火温度的时候略微比tm低一点,适当的调整,多多尝试,就好了.

Answer 2

Tm值不用那么在意，差不多就行，我一般是按照引物单上的。基本上你用不同的软件检测同一条引物就会出现不同的Tm值。Touchdown
PCR最后应该在那个降低下来的最低温度上继续循环。