Question

DNA提取与琼脂糖凝胶电泳过程中常见的问题和细节，有大佬能详细的回答一下吗？

Answer 1

分子生物学质检琼脂凝胶电泳FAQ，
琼脂糖凝胶电泳是最基本的分子生物学实验技术之一，是southern杂交、EMSA等实验的基础。其原理是：因为核酸是两性解离分子，在高于其等电点时，其磷酸基团全部解离，故在电泳缓冲液中带负电荷，加电时向正极迁移。琼脂糖形成的凝胶有许多网孔，发挥分子筛的功能。由于DNA的荷质比几乎固定，故DNA泳动的阻力与其大小及构象密切相关。本文将会介绍琼脂糖凝胶电泳的注意事项与常见问题解析。
一、注意事项
（1）底板一定要用胶带封紧，否则灌胶时凝胶会漏出。可以在灌胶时先倒少量凝胶在交界处，利用凝固的凝胶将其封紧。
（2）梳子一定不能插到底部，应距离底部1-2mm，否则拔梳子时容易弄破凝胶，导致漏胶。
（3）加热时应注意不要让琼脂糖沸腾得太厉害，稍稍沸腾至溶液清凉，即其全部溶解即可，过度沸腾会导致凝胶实际浓度的提高。
（4）将凝胶放入电泳槽时要注意极性，不要正负极颠倒。要注意撕去两端的封带。
（5）凝胶的浓度与待分离的DNA的大小有关。一般浓度为1%，低浓度的胶特别易碎，要注意。
（6）溴酚蓝的迁移速率约与400-500bp的DNA相同。
（7）要防止强诱变剂EB的污染，还要注意对紫外线的防护。
二、常见问题
1.条带模糊
有几个可能原因：①DNA在某一步骤中已被降解，实验过程中要避免核酸酶的污染
②DNA上样量过多，导致“超载”。应减少凝胶中DNA上样量
③电泳设置条件不合理。电泳时电压不应超过20V/cm，温度＜30℃；巨大DNA链电泳，温度应＜15℃
④缓冲液失效，检查缓冲液是否有足够的缓冲能力
2.DNA条带弱或者没有DNA带
①DNA上样量不够,增加DNA的上样量;
②DNA走出凝胶,缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度;
③对于EB染色的DNA，所用光源不合适,应用短波长（254nm）的紫外光源
3.DNA带缺失
①分子大小相近的DNA带不易分辨,增加电泳时间，核准正确的凝胶浓度;
②DNA链巨大，常规琼脂糖凝胶电泳不合适,可以尝试在脉冲凝胶电泳上分析。