Question

试述蛋白质样品制备技术的原则

Answer 1

蛋白质样品制备是实验室研究的关键步骤，其目的是获得纯净、功能活跃并适于后续实验分析的蛋白质。以下是蛋白质样品制备技术的一些基本原则：
1.样品处理的一致性：
在整个实验过程中，应该尽量保持样品处理的一致性，以避免引入人为误差。使用相同的方法和条件来处理不同的样品，包括对照组和实验组。
2.样品保存：
蛋白质样品在采集后应立即处理或冷藏保存。冻存样品时，应使用液氮或-80°C的冷冻器，以防止蛋白质降解。
3.样品清洁：
避免样品受到污染，使用洁净的工作台、实验器具和手套。确保所有工具、试剂瓶口和管子都是干净的。
4.蛋白质溶解：
蛋白质需要在适当的缓冲液中被溶解。选择合适的缓冲液，pH值应符合蛋白质的最佳溶解条件。通常使用Tris-HCl、PBS、或HEPES等。
5.蛋白质浓度测定：
测定蛋白质样品的浓度非常重要，以便在后续实验中使用正确的样品量。可以使用Bradford、BCA或Lowry等方法来测定蛋白质浓度。
6.样品冷却：
在制备样品时，尽量保持样品处于低温，以减缓蛋白质降解的速度。可以在冰盒中操作或使用冷却设备。
7.避免蛋白质降解：
避免长时间的离心、曝露于高温、pH改变或酶活性的存在，以减少蛋白质降解。
8.蛋白样品存储：
制备好的蛋白质样品应尽快使用，或者冷冻保存。对于长期存储，使用-80°C的冷冻器，并使用合适的冻存缓冲液。
9.记录详细信息：
在整个样品制备过程中，应记录详细信息，包括样品来源、处理步骤、浓度等，以便在后续实验中追踪和分析。
以上原则可以帮助确保蛋白质样品制备的质量和一致性，从而获得可靠的实验结果。不同的实验可能需要采取不同的步骤和条件，因此在样品制备前应仔细考虑实验的具体要求。

Answer 2

1.
避免冷冻干燥
尽管有一些蛋白是经冷冻干燥处理后长出了晶体，但是大多数情况下并非如此。所以要尽可能避免冷冻干燥。如果蛋白已经这样了，准备点晶体之前，要用水或者缓冲液透析，除掉非挥发性的试剂和其他化学物质。
2.
避免硫酸铵沉淀
避免硫酸铵沉淀法作为纯化的最后一步或使用硫酸铵沉淀法来浓缩蛋白。因为硫酸铵很难除干净，对后续的结晶过程造成干扰。残存的微量的硫酸铵也会干扰晶体筛选的条件，造成结果的不可重复性。微量的硫酸铵也容易造成样品沉淀，以及在PEG和盐类物质存在时会出现过量的晶核。
3.
蛋白批次
在同一次条件筛选时，要避免样品不是同一批次纯化出来的。每一次纯化的条件和步骤都是不同的〔就像天下没有两片相同的树叶（Redondo添加）〕，所以筛选的时候应该使用同一批次纯化出来的蛋白。
4.
定性蛋白质
在拿去点晶体之前，应该定性判断你纯化出来的蛋白是不是你的目的蛋白。根据确定了的蛋白质性质，可以给筛选和优化提供参考。常用的蛋白质定性试验包括：
SDS-PAGE
Native
PAGE
Dynamic
Light
Scattering
IEF
(Isoelectric
Focusing)
Gel
Mass
Spectroscopy
根据这些试验的结果，我们可以判断：
蛋白样品的纯度
蛋白样品的同次性
不同批次纯化出来的蛋白的性质差异
蛋白质的稳定性
5.
蛋白需要达到什么纯度？
要拿去筛晶体，蛋白样品需要达到什么纯度？答案是越纯越好。但是这样一个答案不能让人满意。如何能更容易理解一些呢？一开始筛选时，根据考马斯亮蓝染色判断蛋白纯度应该达到90
到
95%。不过，考虑到总有进一步纯化的步骤，不可能达到‘绝对’的100%纯，所以没有必要追求‘绝对’纯，存在一点点的杂质蛋白是可以接受的。还要记住，结晶本身就是一个纯化过程。当筛选过程中没有晶体长出，甚至没有长的迹象，或者在优化条件时不能进一步提高晶体的质量了，这个时候就要考虑进一步提高蛋白浓度了。