Question

image J 软件对荧光图片的要求？荧光共聚焦照相的时候要怎么照？能否叠加？

Answer 1

这在ImageJ里是比较常用的操作，既然两天了也没有人回答，我就唠叨一下吧。
基本上，没有特别要求，怎么照都行，可以叠加。
广义上，共聚焦图像的叠加，通常有不同两种情况：
1，multichannel，双重或多重荧光标记，不同通道不同颜色荧光，这种叠加可称为merge；
2，stack，多层光切片的叠加，一般是Z轴方向，可以有多种算法，这种叠加可称为project。

当然，这两种情况也可以共同出现（为简单见我这里只说单纯情况），一般这两种情况的处理方法不同。
我感觉你是第一种情况。我就按这个说吧：
可以根据你所使用的共聚焦提供的软件设置每个通道为不同的颜色。其实，本质上来说都是伪彩（pseudocolor），就算你用同一种颜色，之后在ImageJ里也可以随意改变成你期望的两种颜色。
我通常用leica的机器，你可能能用别牌子的机器，这都没有关系。一般机器输出的图片都可以从中分离或者在confocal自带的软件里导出成.tiff格式,这个格式大多软件都认，也包括ImageJ。
现在我默认你已经有了两个来自于同一个样品的不同荧光通道的tiff图片，现在你在imageJ里面依次将它们打开，现在到ImageJ主界面菜单栏——》Image——》color——》mergechannels选中，会跳出colormerge对话框，有几个选项我不多讲了，按着软件的默认OK就行了。试试吧

另外，如果你是Zeiss的confocal输出的文件，ImageJ（V1.45）有现成的plugin，操作会更方便一点。
还有问题的话不妨先看看help。

追问

我照的样本是球状，球内分布多个点，一个层面有时候看不到所有的点，因此扫多个层面叠加成tif格式的了，但有的一个层面就都看到了，所以只照一次；想做半定量分析，照共聚焦的老师说不行，但很多文献里都是照个共聚焦然后imageJ半定量，真是不懂具体怎么操作，先谢谢你了

追答

你的追问好像超出了原来的提问，似乎是另一个问题了。
没想到你还真涉及project，你的最初提问强调荧光嘛，我猜多通道的可能性大，呵呵。

首先，我们要确定，你的样品是足够薄——如果太厚的话，肯定你扫的层越多，project之后你的“点”越多了，那么单层的和多层叠加的结果一般来说没有可比性。
第二，你的问题已经转向计数了，这个操作步骤比较多，而且根具体的样品有很大关系，我也不知道您是否具有一定图像处理的知识背景，讲起来要打很多字而且你也不见得看明白。我只提示一点：你的图片经过适当强处理后在菜单栏找Analyze——》Analyze Particles这个功能可以解决问题。更具体操作你可以自己先读一读help的相关内容。
祝你成功