Question

把目的基因连接到质粒上构建重组质粒时该如何选择限制性内切酶？引物如何设计？

质粒酶切位点有BamHI,EcoRI,HindIII,Pstl,Smal,Xbal,Xhoi,目的基因上有BamHI,BgII,Smal，Xmal 等，重组时该选哪个限制性内切酶？怎么设计引物引物？

Answer 1

重组时选择你的目的基因上没有，而质粒的多克隆位点上有的酶切位点，一般重组质粒需要两个酶，所以你要选择两个酶切位点，注意尽量避免使用切出平末端的酶。重组引物设计时首先你要确定你选择的两个酶在的酶切位点在质粒的多克隆位点上的排列顺序，这个不能错，不然序列就会接反。一般设计重组引物的时候，在上游引物5’端前面加上载体多克隆位点排列在前面的酶切位点序列，在下游引物5‘端前面则加上后面的一个酶切位点，酶切位点加好后，注意5’端还需要加上保护碱基，这个具体你可以去查下内切酶的说明书。然后你要注意，根据你的载体需要，是否要在引物上带上启动子和终止子。