Question

菌落PCR做了10次还是不成功···

我是第一次做菌落PCR，但是做了10次都没成功···
用菌是JM83菌，在平板上培养成菌落的，做的时候就挑一点菌进体系中。
我的体系是 mix 混合液（里面包含了dNTP、buffer、Taq酶、Mg离子之类的东西）这是买来可以直接用的，但是不知道里面的含量是多少，不过据说是没问题的。
mix 混合液 10ul
Prime 1 2ul
Prime 2 2ul
ddH20 5ul
模板 1ul
模板是直接挑菌用，没有经过处理的。
然后混合好后直接就拿去P了，但是没成功过。
后来我同学说把菌体处理一下，就是沸水浴加热5min然后高速离心取上清做模板。还是不行。
后来有一次，我不小心把做感受态细胞的水当做ddH2O了，并且退火温度做了一个梯度对比，在大约50到55之间出了一点东西，是750pb的，不是我的目的片段的大小，我的目的片段大概在1300左右。那个水中mg离子浓度相当高，是80mM，里面还有20mM的Ca离子。
所以我就认为是不是mix的mg离子浓度不够，所以今天在体系中加了25mM，2.5ul的Mg离子，而ddH2O就只加了2.5ul。可是出来的结果却是Marker跑得不错，但是10个样中都只有引物···这还是没出结果···现在都不知道该怎么办了···

Answer 1

按你的实验体系来看你的mix是2×的吧，同时你的引物应该是5uM左右的吧？
重复你的实验，但做如下改进：
1，挑菌进500ul的ddH2O，充分混匀，不需煮，取1ul做模板，你之前直接挑菌，模板有可能过多，也会p不出带；（也可以先把克隆挑到1-5ml的LB中摇菌1小时，直接取1ul来做模板）
2，设阴性对照以及阳性对照（用有目的片段的质粒或菌为模板），如果阳性对照能出来，而你还没p出来，就说明你的菌里没目的片段。
3，你的片段为1.3kb，如果你用的是普通taq的mix，那么你的延伸要设90s或100s才够，退火温度将梯度设在52-60℃。酶离子就别多加了。
此外，检查你的平板是不是太长时间了，抗生素失效？会造成质粒丢失，自然p不出来。

追问

我们设温度是
95℃ 5min
95℃ 40s
50~56℃ 40s
72℃ 1分30秒
72℃ 5min

追答

这没问题，没p出来确实奇怪，按我的建议，你再试试。菌应该是很好p的

追问

我的引物浓度是10uM```不是5uM···浓度是按买来的说明书上配的···100mM稀释到10mM···难道高了么？师兄都说这个浓度是可以的···

追答

一般引物的终浓度落在0.1-1uM之间比较好，我一般做是在0.5，所以我推测你的是5uM，你的是10uM，按你的体系最终是在1uM，这也没关系，只是稍有浪费，可能会有更多的引物二聚体。
你的实验，引物只要设计没问题，浓度不是关键，你重复了这么多次，我觉得问题还是可能出在模板，也就是你的克隆中到底有没有目的片段。
如果pcr再做不出来，你就干脆提摇菌，提质粒，做双酶切鉴定，看能否切出你的目的片段。如果能，就测序看看，如果不能，那就是阴性。

追问

用了一个高保真酶，体系不用MIX了，自己配的···最后终于做出来了···%>_<%

追答

p出来就好，俗话PCR是魔鬼……

Answer 2

你的菌可能不是阳性的，所以没有条带，你最好做酶切，然后连载体，最后用蓝白斑来筛选。。。

追问

菌是G-的，但是阴性菌壁比较薄···比较容易成功吧···

追答

跟你是革兰氏阴性和阳性有啥关系，所谓的阳性是没有目的条带的菌可能不存在，还不明白么。。。

追问

额····

追答

你如果确定是阳性的，那请告诉我你P菌液的目的是什么。。。

追问

= =我没做过阳性对照，不懂···不过体系自己配，换了一种高保真酶，最后终于P出来了

追答

那就好了，mix的我是从来不会用的。。。

Answer 3

请问你怎么就确定目的片段一定连进载体了呢。。。。 这个体系引物太多了 各0.5ul足矣

追问

引物不多吧···是按照说明书配的引物···100mM的储存液稀释10倍，10mM的引物还多么····

追答

真的多了。。。关键还是你这根本就没连进去目的片段知道不。。。不是PCR的问题

追问

好吧···用了一种高保真酶，没用MIX，体系是自己配的，终于P出来了···%>_<%

追答

那估计你mix坏了。。。呵呵