Question

western blot实验步骤

Answer 1

western blot实验操作步骤如下：

1. 准备样品

1）制冰，准备冰盒。

2）配制细胞裂解液：根据细胞数量确定所需裂解液：50ul/六孔板一孔 。

裂解液配方：100ul碧云天裂解液+1ul蛋白酶抑制剂混合物+1ul PMSF

3）按实验需要准备好细胞：去掉培养基，1×PBS洗3次（去掉培养基中的血清），每个孔（6孔板）加入适量的裂解液。迅速用细胞刮刮下细胞并转移至1.5ml管中，置于冰上20min，振荡混合后，再置冰上10min。

2. SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳：制备分离胶（5ml/gel）

3. 膜转移

1) 切胶，按Marker指示和目的条带的位置切胶(注意将胶切角做记号)，将洗脱的胶浸入转膜缓冲液中15分钟。

2) PVDF膜做好记号后先浸入甲醇中1分钟，再连同4张3mm滤纸和海绵浸入转移缓冲液中15分钟。