Question

细胞水平及分子水平的生物测定是怎样的？

Answer 1

传统的生物测定方法虽然所得数据较为可靠，但是往往所需要的时间较多，且供试药剂的需求量较大，现在新农药的筛选，供试化合物动辄几万个甚至更多，传统的方法根本无法满足数量巨大的筛选要求。基于以上原因，近年来，许多新的生物测定方法层出不穷。

（1）预期作用靶标抑制活性的测定。随着农药作用于昆虫的靶标部位、昆虫体内农药的代谢解毒机制渐渐为人们认知，通过检测供试药物对靶标或代谢物质的作用，可以简化生物筛选测定的步骤与时间，这也是生物合理设计农药的重要思路。

（2）MTT法。MTT（methylthiazoletrazolium）是一种黄色水溶性四噻唑蓝，活细胞中的琥珀酸脱氢酶可使MTT分解产生紫色结晶状颗粒积于细胞内和细胞周围。其量与细胞数呈正比，也与细胞活力呈正比，但是死细胞不具有这个能力。因此，用一定浓度的药剂处理指数生长期的细胞后一段时间，加入MTT，再测出所有混合液体的吸光值，可推出细胞的活力，衡量供试药剂的毒力大小。

一般步骤是首先培养昆虫细胞系，如棉铃虫细胞系、烟草夜蛾细胞系，取对数生长期细胞，置96孔微量滴定板中培养一定时间（使细胞贴壁），然后加入待测化合物，并继续培养24h，结束培养前一定时间，向孔内加入MTT母液，培养结束后弃去上清液，再向孔内加入一定溶剂，待生成物完全溶解后，置酶联检测仪上于570nm处读取吸光度值，通过细胞死亡率高低初步判断化合物有无活性，还可设置系列样品浓度，最终求出LD50/LC50值，以判断活性大小。

MTT法需要专门的无菌操作台及相配套的细胞培养设备，成本较高。但是，此法对药剂所需要的剂量少，能很好的满足现在高通量筛选等筛选技术的要求。

（3）生物传感器。生物传感器是一种以生物的部分活性物质作为敏感部件，结合物理化学分析仪器，对特定种类化学物质或生物活性物质具有选择性和可反应的分析装置。其中关键技术原理是传感器的生物敏感层与复杂样品中特定的目标分析物之间（如酶与底物、抗体与抗原、外源凝集素与糖、核酸与互补片段之间）的识别反应会产生一些物理化学信号（如光热、声音、颜色、电化学）的变化，这些变化通过不同原理的转换器（如光敏管压电装置、光极光敏电阻、离子选择性电极等）转换成第二信号（通常为电信号），经放大后显示或记录。

生物传感器按照识别元件可分为三类：基于分子（酶、抗原或抗体、受体、核酸、脂质体等）的传感器、基于细胞的传感器和基于组织切片的传感器。就敏感元件而言，前者是固定化的生物体成分，后两者是生物体本身。基于分子的生物传感器具有高度选择性和敏感性，只对一靶分子有响应。正因为这种高度选择性，可能会使某些具有相同功能的相关分子检测不到。而将活细胞作为探测单元，可以检测到许多未知的物质。目前生物传感器主要用于环境监测（生化武器、地下水污染等）、药物筛选、新药开发和基础神经学等研究，在农药领域的应用正在起步。

例如测定昆虫电生理反应。其原理是昆虫产生拒食行为与药剂刺激昆虫的味觉感受器如中栓锥感受器有一定的相关性，用供试药液刺激昆虫的中栓锥感受器，同时，将电极连接该感受器，通过电子设备接受并放大感受器发出的脉冲信号，用示波器或记录器记录这些信号，或直接输入电脑通过特定的处理软件对信号进行分析，判断活性的有无或大小。华南农业大学曾就炔类化合物和川楝素对亚洲玉米螟拒食活性与电生理反应做了相关的研究工作。

（4）生物芯片。生物芯片（biochip）技术，采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子，如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等生物样品有序地固化于支持物（如玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体）的表面，组成密集二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过特定的仪器，如激光共聚焦扫描或电荷耦联摄影像机（CCD）对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子数量。

目前，生物芯片包括基因芯片、蛋白质芯片、组织芯片等。在已知的防治昆虫靶标中，可以将多种害虫的细胞、作用靶标或核酸片断同时制作在同一生物芯片上，以供药物的筛选。芯片技术具有高通量、大规模、平行性等特点，可以进行新药的筛选，也可采用生物芯片技术来寻找潜在药物靶标。用芯片做大规模的筛选研究可以省略大量的动物试验，缩短药物筛选所用时间。