Question

一般引物长度为18~30碱基，这里的长度指的P+、P-总长度吗，还是分开的，包不包括保护碱基和酶切位点的长度

一般引物长度为18~30碱基，这里的长度指的是上、下游序列（P+和P-）的总长度吗，P+和P-的Tm值不同，退火温度该怎么计算？根据以下图片显示引物长度和Tm值分别是多少？

Answer 1

不是，是单指上游，下游，即上下游均为18-30个碱基，上下游的Tm值最好不要相差大于5.一般在合成引物后在合成单上有一个Tm值，可在其基础上做一个梯度PCR，从而确定最佳的Tm值。