Question

真菌的DNA提取方法有哪些，要详细操作步骤

Answer 1

（一）
1.取真菌菌丝0.5g, 在液氮中迅速研磨成粉
2.加入4mL提取液，快速振荡混匀
3.加入等体积的4mL的氯仿:异戊醇(24:1)，涡旋3～5min（此处是粗提没有加酚，可以节约成本的哟！）
4.1000rpm，4℃，5min
5.上清用体积的氯仿:异戊醇(24:1)再抽提一次（10,000 rpm，4℃离心5 min）
6.取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇或2.5倍体积的无水乙醇沉淀, 混匀, 静置约30 min
7.用毛细玻棒挑出絮状沉淀, 用75%乙醇反复漂洗数次, 再用无水乙醇漂洗1次, 吹干，重悬于500 ulTE中
8.加入1 ul RNaseA （10 mg/mL），37℃处理1 hr
9.用酚（pH8.0）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次（10,000 rpm，4℃离心5 min）
10.取上清，1/10V 3M NaAc,2.5V体积的无水乙醇, -70℃沉淀30 min以上
11.沉淀用75%乙醇漂洗，风干, 溶于200 ulTE中，-20 ℃保存备用
DNA提取液：0.2M Tris-HCl（pH 7.5），0.5M NaCl，0.01M EDTA，1％SDS，
3M NaAc
（二）
1.真菌菌丝0.5-1 g, 在液氮中迅速研磨成粉
2.加入3 mL 65℃预热的DNA提取缓冲液，快速振荡混匀65℃水浴30 min, 期间混匀2-3次
3．加入1 mL 5M KAc，冰浴20 min
4．等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次（10,000 rpm，4℃离心5 min）
5．取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇, 混匀, 静置约30 min
6．用毛细玻棒挑出絮状沉淀, 用75%乙醇反复漂洗数次, 再用无水乙醇漂洗1次, 吹干，重悬于500 L TE中
7．加入1 ul RNaseA （10 mg/mL），37℃处理1 hr
8．用酚（pH8.0）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次（10,000 rpm，4℃离心5 min）
9．取上清，1/10V 3M NaAc,2.5V体积的无水乙醇, -70℃沉淀30 min以上
10．沉淀用75%乙醇漂洗，风干, 溶于200 ul TE中，-20 ℃保存备用。

Answer 2

1.真菌菌丝0.5-1 g, 在液氮中迅速研磨成粉
2.加入3 mL 65℃预热的DNA提取缓冲液，快速振荡混匀65℃水浴30 min, 期间混匀2-3次
3．加入1 mL 5M KAc，冰浴20 min
4．等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次（10,000 rpm，4℃离心5 min）
5．取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇, 混匀, 静置约30 min
6．用毛细玻棒挑出絮状沉淀, 用75%乙醇反复漂洗数次, 再用无水乙醇漂洗1次, 吹干，重悬于500 L TE中
7．加入1 ul RNaseA （10 mg/mL），37℃处理1 hr
8．用酚（pH8.0）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次（10,000 rpm，4℃离心5 min）
9．取上清，1/10V 3M NaAc,2.5V体积的无水乙醇, -70℃沉淀30 min以上
10．沉淀用75%乙醇漂洗，风干, 溶于200 ul TE中，-20 ℃保存备用。
DNA提取缓冲液：100 mM Tris-HCl（pH8.0）,20 mM EDTA（pH8.0）,1.5 M NaCl, 2% CTAB(W/V),4% PVP40(W/V)和2% 巯基乙醇(V/V)，PVP和巯基乙醇使用前加入
5M KAc

Answer 3

真菌的DNA提取方法：
一、SDS法
基本原理是研磨的组织细胞用热的SDS裂解后，加入高浓度的KAc，0℃放置以除去蛋白和多糖类杂质，最后用乙醇或异丙醇沉淀。
1、 试剂
(1)提取缓冲液
Tris-HCl 100mmol/L（pH8.0） EDTA 50mmol/L （pH8.0） NaCl 500 mmol/L 灭菌后加β-巯基乙醇至10 mmol/L
(2)裂解液20%SDS
(3)高盐溶液5mol/L KAc
(4) RNaseA 10mg/ml
(5) 异丙醇
(6)灭菌ddH2O或TE
2、 仪器
离心机， 恒温水浴, 台式高速离心机，电泳装置
3、实验程序
（1）、离心菌体，再用灭菌ddH2O冲洗2次，放入经液氮预冷的研钵中，加入液氮研磨至粉末状，用干净的灭菌不锈钢勺转移粉末到加有500μL提取液的离心管中,轻轻混匀。
（2）、 向管中加入50μL20%SDS溶液，混匀，不可过于强烈震荡以防基因组DNA断裂 ，65℃保温10min，并不时摇动。
（3）、 加入150μL 5mol/L KAc，混匀，置冰上20-30 min。
（4）、 4℃,15 000rpm离心15min,转移上清到另一离心管中，加入0.7V的异丙醇，混匀，-20℃沉淀30 min 。
（5）、12 000rpm离心10min回收基因组DNA沉淀，吹干后加入适量的灭菌ddH2O或TE溶解DNA。
（6）、 加入1/10体积的RNaseA，37℃保温20min，除去RNA。
（7）、 C：I抽提后，加2V乙醇，-20℃沉淀30 min 。12 000rpm离心10min回收基因组DNA沉淀。
（8）、 用400μL 70%乙醇洗一次后，吹干，加入适量的灭菌ddH2 O或TE溶解DNA。
（9）、 电泳检测完整性。
二、蜗牛酶破壁法
（一）、试剂：
1、500 μL PBS（0.01 mo l/L N a2 HPO4 和N aH2 PO4, pH7.0, 0.15 mol /L NaCl）
2、蜗牛酶溶液中（0.1 mo l/L 磷酸缓冲液, pH7.4, 0.25mo l/L MgC12用0.22 μm 细菌滤膜过滤除菌）
3、裂解液（2% Triton X-100, 1 % SDS, 0.1 mol/L NaCl，10 mmol/L T 、Tris-HCl，pH8.0, 1mmol /L EDTA）
4、5mol/L KAc( pH 8.9)
（二）、实验程序
1、离心菌体，沉淀中加入500 μL PBS（0.01 mo l/L N a2 HPO4 和N aH2 PO4, pH7.0, 0.15 mol /L NaCl）重悬, 12 000 r /m in 离心2 m in; 弃上清, 重复悬浮一次
2、沉淀溶于100 μL 含20 mg /mL 的蜗牛酶溶液中（0.1 mo l/L 磷酸缓冲液, pH7.4, 0.25mo l/L MgC12用0.22 μm 细菌滤膜过滤除菌）
3、45℃ 作用2 h
4、加100 μL 裂解液（2% Triton X-100, 1 % SDS, 0.1 mol/L NaCl，10 mmol/L T 、Tris-HCl， pH8.0, 1mmol /L EDTA）
5、- 20℃ 冷冻, 然后室温震荡溶解, 反复3次
6、向悬浮液中加入150 μL 5mol/L KAc( pH 8.9)轻轻混匀
7、10 000 r/min离心5 min; 将上清转移到一新的1.5 mL离心管中
8、乙醇沉淀