Question

为什么要测定dna的浓度和纯度

Answer 1

首先,分光光度计测量的样品必须是均一的,摇匀后再测量结果会准确些.它是利用分光光度法对物质进行定量定性分析的仪器.
核酸的定量是分光光度计使用频率最高的功能.可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸,单链、双链DNA,以及RNA.核酸的最高吸收峰的吸收波长260 nm.每种核酸的分子构成不一,因此其换算系数不同.定量不同类型的核酸,事先要选择对应的系数.如：1OD 的吸光值分别相当于50μg/ml的dsDNA,37μg/ml的ssDNA,40μg/ml的RNA,30μg/ml的Olig.测试后的吸光值经过上述系数的换算,从而得出相应的样品浓度.测试前,选择正确的程序,输入原液和稀释液的体积,尔后测试空白液和样品液.然而,实验并非一帆风顺.读数不稳定可能是实验者最头痛的问题.灵敏度越高的仪器,表现出的吸光值漂移越大.
事实上,分光光度计的设计原理和工作原理,允许吸光值在一定范围内变化,即仪器有一定的准确度和精确度.如Eppendorf Biophotometer的准确度≤1.0%（1A）.这样多次测试的结果在均值1.0%左右之间变动,都是正常的.另外,还需考虑核酸本身物化性质和溶解核酸的缓冲液的pH值,离子浓度等：在测试时,离子浓度太高,也会导致读数漂移,因此建议使用pH值一定、离子浓度较低的缓冲液,如TE,可大大稳定读数.样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素：由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒,尤其是核酸样品.这些小颗粒的存在干扰测试效果.为了最大程度减少颗粒对测试结果的影响,要求核酸吸光值至少大于0.1A,吸光值最好在0.1-1.5A.在此范围内,颗粒的干扰相对较小,结果稳定.从而意味着样品的浓度不能过低,或者过高（超过光度计的测试范围）.最后是操作因素,如混合要充分,否则吸光值太低,甚至出现负值；混合液不能存在气泡,空白液无悬浮物,否则读数漂移剧烈；必须使用相同的比色杯测试空白液和样品,否则浓度差异太大；换算系数和样品浓度单位选择一致；不能采用窗口磨损的比色杯；样品的体积必须达到比色杯要求的最小体积等多个操作事项.
除了核酸浓度,分光光度计同时显示几个非常重要的比值表示样品的纯度,如A260/A280的比值,用于评估样品的纯度,因为蛋白的吸收峰是280nm.纯净的样品,比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）.如果比值低于1.8 或者2.0,表示存在蛋白质或者酚类物质的影响.A230表示样品中存在一些污染物,如碳水化合物,多肽,苯酚等,较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0.A320检测溶液的混浊度和其他干扰因子.纯样品,A320一般是0.