Question

琼脂糖凝胶电泳常见问题有哪些

Answer 1

琼脂糖凝胶电泳是用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。对于分子量较大的样品，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。琼脂糖凝胶电泳常见为题都有哪些？
DNA带模糊
DNA降解：琼脂糖凝胶电泳试验中要避免核酸酶污染
电泳缓冲液陈旧：电泳缓冲液多系使用后，离子强度降解，PH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳实验，建议经常更换电泳缓冲液。
所用电泳条件不合适：电泳时电压不应超过20V/cm，温度<30℃；巨大DNA链电泳，温度应该<15℃；检车所有电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力
DNA上扬量过多：应减少凝胶中DNA上样量。
DNA样含盐量过高：电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐。
有蛋白污染：电泳前酚抽提去除蛋白
不规则DNA带迁移
对于λ/HindⅢ片段cos位点复性：电泳前于65℃加热DNA5分钟，然后在冰上冷却5分钟。
电泳条件不合适：电泳电压不超过20V/cm；温度<30℃；经常更换电泳缓冲液。
DNA变性：以20mM NaCI Buffer稀释DNA，电泳前勿加热。
带弱或无DNA带
DNA的上样量不够：增加DNA的上样量；聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖凝胶电泳灵敏度稍高，上样量可适当降低。
DNA降解：避免DAN的核酸酶污染
DNA走出凝胶：缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度。
对于EB染色的DNA，所用光源不合适：应用短波长（254mm）的紫外光源
DNA带缺失
小DNA带走出凝胶：缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度。
分子大小相近的DNA带不易分辨：增加电泳时间，核准正确的凝胶浓度。
DNA变性：电泳前请勿高温加热NDA链，以20mM NacI Buffer稀释DNA
DNA链巨大，常规凝胶电泳不合适：在脉冲凝胶电泳上分析。
综上所诉，琼脂糖凝胶电泳实验需注意以下几点：
1.体系配制时候最关键的几个试剂一定要确定它们还有效、或者还没被污染：引物，酶，超纯水。这些东西最好自己收好，写上个人的名字放好，冰盒上记得带上橡皮筋，这样就不会因为别人翻冰箱时候把你的冰盒碰散了，试剂都碰掉。否则，你的试剂被污染了，到时候阴性对照狂出条带，再去找污染源很麻烦。而且配置体系时候要注意保持实验区的干净，事先可用小喷壶进行酒精喷雾，固定空气中的DNA，而且全程要戴手套，避免污染体系。
2.pcr体系要摸准，最好用人家都做得很多的老体系来上手。
3.要想得到漂亮的电泳图，可以在PCR开始时候就把胶倒上（前提是你的PCR总时间在1.5小时左右，并且1.5小时候之后你还在实验室。），让凝胶凉着，这样凝胶的上样孔会比较规则，胶体里面的其本身的孔径也会较规则。如果你要第二天再跑胶，千万记得把PCR完毕的样本放入4℃保存。第二天做时候建议把胶凉上25分钟左右。
4.琼脂糖凝胶电泳上样时候建议使用排枪上样，不仅快速而且样本加到胶孔里的速度一致。当然，排枪上样最好选用进口枪头，国产枪头就不要想了。
5.不管电泳室使用的频率高还是低，我都建议每次琼脂糖凝胶电泳时候更换电泳液，避免出现“＾”形条带。