Question

悬浮细胞的转染怎么做

Answer 1

悬浮细胞的转染方法：（以下内容转自生物帮资讯）
DXY721认为：
悬浮细胞和贴壁细胞在转染过程中差别不大，主要差别在于转染后的筛选，当然如果你做的是瞬时转染就不存在筛选的问题了。
其实转染的过程很简单，问题是能不能转的进去的，转染率能有多少，转进去是否可以稳定表达目的蛋白等等。
我们也是用脂质体做悬浮细胞的转染，说明书上都有具体的操作过程，将脂质体和目的基因按比例混合，然后加到细胞悬液里就OK了，说的简单，实际上还是有一些细节要注意的，比如脂质体和目的基因混合的比例，转染的细胞数，细胞的代数，细胞的状态，有的还要求在转染的前一天传代一次，不过不要怕，这些在脂质体说明书上都有明确的说明，按照说明书做就可以了。
jinghuanlv认为：
悬浮细胞和贴壁细胞转染还是有很大不同的。
脂质体转染的原理基于电荷吸引原理，先形成脂质体-DNA复合物，散布在细胞周围，然后通过细胞的内吞作用，将目的基因导入细胞内，而脂质体复合物与贴壁细胞的接触机会比悬浮细胞高出很多倍，所以，脂质体转染时悬浮细胞的转染效率要明显低于贴壁细胞。
我们实验室转染悬浮细胞是用的电穿孔法，目前为止，悬浮细胞转染的最好方法还是电转，我们实验室用的电转仪是Bio-Rad的，使用条件是电压250V，电容975uF，效果不错，不妨一用。

Answer 2

操作步骤：本说明书适用于 24 孔培养板的转染实验，其他规格的培养板的用量参照下面表格，表格给出的是每孔的用量与体积。
A. 细胞接种：转染前一天接种细胞，每孔 500 μl 培养基（不可加抗生素），使细胞在转染时密度在 30-40% 。
B. siRNA-RFectSP 混合物准备：
1. 6pmol siRNA 用 50μl 无血清培养基稀释。
2. 2μl RFectSP 用 50μl 无血清培养基稀释。轻轻混匀，室温孵育 5min。注意：确保在 25 min 内执行第三步操作，不要过于延迟。
3. 孵育 5min 后，将 siRNA 稀释液与 RFectMN 稀释液混合（总体积 100μl）。轻轻混匀，室温孵育 20 min。
C. 将混合物加到培养的细胞内（完全培养基培养）：
1. 将 100μl 混合物加入培养孔内，培养孔内含有 0.5ml 培养的细胞。轻轻晃动培养板 5min，混匀。
2. 37°C 培养 48-72h，检测基因抑制效果。如果需要，细胞培养 4-6h 时可以更换培养基，但不是必须。孵育时间的长短，取决于细胞类型、所干扰基因本身及分析方法。可设置不同的孵育时间进行实验以确定最佳孵育时间。
转染实验优化: 为了提高转染效率，最好对转染条件进行优化，特别是首次使用。例如：24 孔培养板，调整 siRNA 与 RFectSP 试剂的用量。
siRNA 用量在 6-60 pmol (final concentration 10- 100 nM)之间调整，RFectSP 试剂用量在 1.0 - 3.0μl 之间调整。转染实验要点
l 转染过程不可添加抗生素，否则会导致细胞死亡；
l 首次实验 siRNA 的用量设置在终浓度 10nM、30nM、50nM、100 nM 进行摸索 ，后续实验根据实验结果修改。