Question

植物组织培养的步骤？

Answer 1

就像我们可以把核酸提取这样一类分子生物学实验粗暴地划分成细胞裂解和核酸纯化两个步骤一样，植物组织培养也有两个核心的步骤，那就是野生材料驯化和组织形态建成。

野生材料的驯化
很多时候，需要使用植物组织培养往往是出于遗传转化受体的需要，抑或是进行不同条件的培养以提取代谢物进行差异分析，出于这样的前提，实验者往往只是搬照文献里给出的培养条件或者做出明确的改动，缺乏的只是材料。

因此，无菌培养是这一类组织培养实验的保障，而将野生材料驯化的过程，即是无菌操作与外植体消毒等一系列与污染作斗争的集中体现。

野生材料驯化的具体措施如下：

1. 灭菌：

通常，我们需要对使用的培养基、培养皿、镊子、解剖刀、去离子水和滤纸进行彻底的灭菌，这样可以彻底杀死器材和培养基中的微生物；

其中，培养基、镊子、解剖刀、去离子水等液体和金属器皿通常采用121℃ 20-30min的湿热灭菌法，玻璃器皿常用180℃ 2h的干热灭菌法，而抗生素、激素等不耐高温的试剂常用过滤灭菌法。

2. 消毒：

消毒是指外植体和操作台面的消毒，目的是在不伤害植物的前提下，抑制和杀死大部分微生物。其中，外植体消毒的方式主要分为表面消毒和侵入消毒两种，对于操作台面的消毒通常是指超净工作台使用前进行的的30min紫外灯消毒和操作过程中的空气滤过消毒，值得一提的是，在使用超净台之前用70 % 酒精擦拭台面会有一定效果。

对于大部分种子、陆生植物的茎叶等，表面消毒足以杀死可能会在组织培养过程中导致污染的微生物，比如70 % 乙醇、5 % 过氧化氢，均可以在短时间内有效杀死表面的微生物；

但对于一些生长在潮湿阴暗环境中的植物来说，通常有着大量的组织内生菌，而这些内生菌往往不是表面消毒可以杀死的，一些侵入式消毒剂会比较有效，如升汞、次氯酸钠等。

3. 无菌操作：

无菌操作即杜绝一切来自操作者的污染或因操作者失误导致的其他污染，一些常见的操作手法如下：

a) 设立单独的组培间，并设立与外界污染区的缓冲间，在缓冲间内更衣进入组培间；

b) 进入组培间前要在缓冲间内进行全身的酒精喷雾消毒，同时换上组培室专用拖鞋；

c) 操作过程中，佩戴手套或肢体不从一切开口器皿的上方经过；

d) 器皿不要遮盖超净台出风口，超净台不要开口太大；

e) 在超净台中点燃酒精灯，操作尽量在酒精灯火焰周围进行；

f) 使用的金属工具和玻璃器皿每进行一阶段的操作后及时进行灼烧灭菌；

g) 镊子、枪头等接触培养基的工具在接触到其他固态表面后立即灼烧灭菌或更换；

h) 做其他分子实验的超净台应与进行组织培养接种的超净台分开；