Question

细胞生物学：小鼠胚胎干细胞培养实验步骤

Answer 1

以下是根据NIH老年病研究所提供的英文的R1胚胎干细胞培养protocol整理而成。根据经验作部分修改。

　　1、一般培养-保持胚胎干细胞处于未分化状态

　　培养基

　　细胞复苏

　　冻存细胞

　　明胶包被

　　细胞传代

　　2 、体外分化

　　培养基

　　包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板（使用或不使用盖玻片）

　　体外分化方法

　　注：以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol和培养基。

　　一般培养——维持ES细胞处于未分化状态

　　ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。如果在Feed细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。下文中暂不提及Feed细胞。Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。

　　培养基

　　ES：

　　配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基——见下文）。分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。通过将21ml该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。贮存于4℃，时间不要超过2周。

　　贮存液

　　DMEM（高糖）

　　马血清（HS）

　　L-谷氨酰胺（200mM）

　　MEM NEAA（10mM）

　　HEPES（1M）

　　β-巯基乙醇（55Mm）

　　PEST

　　LIF

　　复苏细胞

　　细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。

　　步骤：

　　1.从液氮中取出一管细胞；

　　2.将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；

　　3.将细胞转移到一15ml Falcon管中；

　　4.加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；

　　5.离心3分钟；

　　6.弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；

　　7.接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿；

　　8.孵育。