Question

如何鉴定提取质粒DNA的质量和含量

Answer 1

紫外分光光度计定量。

方法用大肠杆菌DH5α感受态细胞克隆丰量的pMD-18T重组质粒，紫外分光光度计定量后，根据重组质粒分子量计算其拷贝数，稀释成梯度浓度的荧光实时定量PCR的标准品，取1.0×106、1.0×104和1.0×102拷贝/μl高中低3个浓度的标准品，反复冻融1、6、11、15次和21次后，以冻融后的质粒标准品为模板同时进行real-time PCR扩增定量，比较量值变化。

高中值稳定，低浓度波动相对较大，高浓度质粒最大变化量为0.06个数量级；中浓度质粒最大变化量为0.18个数量级；低浓度质粒最大变化量为0.34个数量级。

扩展资料：

质粒DNA提取的要求规定：

1、以CaCl2沉淀法去除大分子RNA，Q-Sepharose和SOURCE两步离子交换层析法去除染色体DNA、小分子RNA、蛋白质等杂质。

2、有效去除质粒DNA制备过程中产生的杂质,可应用于药剂水平质粒DNA的制备。

3、L.P.Elwell的实验条件稍作改进，温和地制备清亮裂解液并抽提质粒DNA，应用Sephacryl S-1000作凝胶过滤，获得了纯度高、产量大，无染色体DNA。

参考资料来源：中国知网-反复冻融质粒标准品对荧光实时定量PCR实验的

Answer 2

用琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒DNA。

琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的常用方法。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。

由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。

不同浓度琼脂糖凝胶可以分离从200bp至50kb的DNA片段。在琼脂糖溶液中加入低浓度的溴化乙锭(ethidum bromide ,EB)，在紫外光下可以检出 10ng的DNA条带，在电场中，pH8.0条件下，凝胶中带负电荷的DNA向阳极迁移。

扩展资料：

质粒DNA提取方法

1，碱裂解法

2，煮沸裂解

3，羟基磷灰石柱层析法

4，质粒DNA释放法

5，酸酚法等。

选择哪一种方法取决于以下几个因素

1，质粒的大小

2，大肠杆菌菌株

3，裂解后用于纯化的技术和实验要求

参考资料来源：百度百科-质粒DNA纯化

Answer 3

根据你提取的总量来看，然后按照一定的稀释比例（洗脱液稀释），然后用分光光度计来测260/280，一般1.8-1.9都还可以，条件好就用nanodrop更好了。然后跑个胶，当然如果你知道你的质粒有哪些酶切位点，也可以酶切了只有一起跑，跑的时候加上marker 看条带大小对不对，有没有拖带什么的。

Answer 4

稀释一定的浓度梯度，粗定量方法：跑琼脂糖胶，跟Marker对比，估算量
可以使用分光光度计，在260和280nm测吸光度，计算得到比较精确值

Answer 5

跑胶加nanodrop相互验证