Question

DNA酶切之后,产物直接电泳,胶回收之后的产物中酶还有活性吗？

没有用EDTA终止反应，电泳和胶回收会使酶失活吗？现在取胶回收产物进行连接转化，转化效率底，平板上未见菌落。怀疑是胶回收的载体中还有酶的活性

Answer 1

你做胶回收的那个柱子，只吸附DNA，就算有蛋白和其他杂质也在胶回收步骤中洗掉了，转化效率低一般不会是这个原因。
你先看看这些步骤有没有需要优化：
1.连接体系：粘末端是否匹配，载体与片段的比例、多少，Buffer，酶量，等等，可以参照连接酶的说明书。
2.转化体系：连接产物不要超过感受态量的10%，加入时不要吹打。
3.如果是自制的感受态，看一下转化效率，是否反复冻融，或者在室温放置较长时间。实验操作是否遵守流程等等。
4.确认一遍载体的抗性和培养基的抗性。

追问

亲，如果酶切之后没有终止反应而直接电泳，在电泳时，酶切会继续吗？

追答

不会的，即使有，你也可以忽略不计。一般酶切反应不终止也没关系，而且酶切需要一定的缓冲液， 不然活性就会大大下降，以至于失活。所以不要纠结酶切这个问题，问题肯定不在这里。