Question

蛋白的表达与纯化

设计实验

Answer 1

蛋白表达纯化已经是非常经典简单的实验了，没有LSS说的那么吓人。
说说我的蛋白表达纯化以及下面的单抗制作工作总体设计概要吧:
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首先要知道你要纯化蛋白的编码DNA序列，查阅相关文献，看目的基因在那些细胞或者组织中高表达，进而设计该基因的引物，扩增出目的DNA片段的ARF。这一布叫目的基因片段的获取
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构建表达载体:根据你获得的基因本身的特性确定原核或者真核载体中表达，这一步的主要问题就是构建带有目的基因的质粒，导入表达系统中。一般原核表达时间短，成本低，表达量大，常优先考虑;但是有些基因在E
coli中就是表达不出，可能是密码子优化等出现问题，也或者是由于想纯化得到更好的活性蛋白的考虑(原核的蛋白折叠系统显然没有真核的好)，有很多研究者选择在毕赤酵母中表达。(我手里就有相关资料，因为以前做过表达纯化及后来的单抗制备)，这一步再强调一下，优化密码子对于蛋白的成功表达很重要
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载体构建好了，下面就是重组蛋白的表达了。这一过程涉及到用多少的诱导剂，诱导多少时间才能得到最多的蛋白的问题，即优化表达条件。就是在上述不同量诱导剂诱导条件下，取菌体上清(分泌型)或者破碎细胞(胞内表达的蛋白)电泳，看是否得到目的分子量大小的蛋白
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蛋白表达成功，下面是根据蛋白质本身亲水/疏水，电荷带电特性等确定蛋白纯化的方法。一般步骤:离心，取蛋白所在的相
如果是分泌表达的蛋白，则取上清，超滤，没有超滤仪器可以用透析袋等代替，用离子交换柱层析。基本上这一步能得到纯化的95%的蛋白，电泳鉴定基本不会看到有杂带出现。如果还是纯度不符合要求，可以在表达蛋白最初在构建表达载体质粒的时候在蛋白的ORF后面加上HIS-标签，这样得到的蛋白不但可以用于HIS柱的进一步纯化，在不确定自己的融合蛋白是否有表达的时候，也可以单单用抗HIS的抗体做一WB，分析确认目的蛋白是否表达，这是蛋白表达的常用手段。
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经过纯化后的蛋白仍然含有一部分无机盐，如果需要的话可以将蛋白经真空冻干机冻干，得到纯蛋白。
我们实验室做出来的一个蛋白，编码序列GC含量高75达%，但是功夫不负有心人，只要你想做那件事情，积极的寻找解决问题的手段，总会搞定的，没有跨不过的坎。如果坎太宽，搭桥解决总行。