Question

酶切位点与保护碱基加入如果有ATG怎么办?

我克隆一个完整的CDS，有ATG，设计的引物上游直接以ATG开始，而下游直接以TTA开始（与TAA互补），那么上游加入酶切位点与保护碱基时，如果有ATG怎么办？

另外，在这种情况下，下游引物还需要加终止密码子互补？
什么情况下要加终止密码子？

Answer 1

没关系的，酶切位点的碱基是要被切掉的，不是吗？
基因上的终止密码子如果没被破坏就不用再加终止密码，如果破坏了当然要加了。

追问

酶切位点的碱基不会被切掉啊。。。之后用此酶切位点连接到表达载体，进行表达。当然是没有被切掉的。

追答

我说的是保护碱基是会被切掉的，保护碱基是加在了酶切位点的外侧，比如GAATTC，假设保护碱基为ATG，那么你引物的这段开头一定是ATGGAATTC，从第二个G切开后再连接到载体上，你自己画画图就明白了。

追问

那就是了。但是如果酶切位点本身就有ATG咋办？是不是说明这个酶切位点不适合啊？
加终止密码子到底是怎么回事哦，没明白

追答

酶切位点含有ATG没有关系，只要不影响你目的基因的阅读框就好了，如果不需要表达位于目的基因后端载体上的某些基因，终止密码子你可以不加，因为基因都有自带的终止密码。

追问

你说的这段有两个不懂的地方：
其一，为什么没关系呢？如果从这个ATG开始翻译，不是就要么仅仅多出来一两个氨基酸（此时原来的起始密码子ATG作为甲硫氨酸密码子），要么就移码阅读框吗？ 而且，你说不影响阅读框就好，怎么能不影响呢？
其二，基因自带终止密码，所以就确实不需要加终止密码子了。而你的意思，似乎有如果需要表达目的基因后的基因就需要加终止密码子。为什么又需要加了呢？到底什么情况要加终止密码？

追答

其一，多几个氨基酸对你的蛋白基本没有什么影响，如果多的是三个、六个、九个碱基那当然不会影响阅读框，具体情况你得根据测序结果分析你的序列；
其二，有些载体比如PET28a，His标签就在多克隆位点后边，如果你想让这个标签和目的蛋白融合表达就要把目的基因中的终止密码子突变掉，让其继续往后表达才可以。

追问

好！我懂你的意思了。确实有融合表达这一个说法。只是我很奇怪，如果连接在一起之后，它们是会被剪切成两段的吗？如果不分开，那你的意思是有两个基因的一条长氨基酸链就能表现出两张蛋白的功能之和？还是说仅仅是这个标签比较特殊？原谅我基础差。
对了，为什么需要融合表达呢？是因为之后标签基因本身没有SD序列么？麻烦了

追答

是啊，把基因连起来，就可以表达融合蛋白的，我们都是这么做的，当然都限于标签的融合表达，分子量都较小。

Answer 2

酶切位点与保护碱基加入如果有ATG，如果你的保护碱基是指酶切位点和目的基因之间的 那ATG是不能存在的；如果是位于引物一端 为了保护酶切位点的保护碱基 那没什么影响。

追问

哦~酶切位点的保护碱基一般是放在5‘端。所以保护碱基最终会被切掉。但是如果酶切位点本身就含有ATG呢，会有影响的吧？

追答

会 还是换个酶吧