Question

那位知道如何添加保护性碱基?需要遵循什么原则？或者知道Apa l 和Afl ll 的保护性碱基也行。谢谢~

Answer 1

百度文库中有免费的限制性酶切位点保护性碱基总结的文献，你直接搜保护性碱基便可，发网址链接要被吞的，我就不发了。

酶切位点设计以及加保护性碱基主要是要避免甲基化位点。
Dam 甲基化酶可在 GATC 序列中的腺嘌呤 N6 位置上引入甲基。有些限制酶对 Dam 甲基化的 DNA 敏感，不能切割相应的序列，如 BclⅠ、 ClaⅠ、 XbaⅠ 等，要设计时注意不能出现GATC 序列，比如在 XbaⅠ位点前加GA。
Dcm 甲基化酶识别 CCAGG 或 CCTGG 序列。受 Dcm 甲基化作用影响的酶有 EcoRⅡ（↓CCWGG）。大多数情况下，其同裂酶 BstNⅠ（CC↓WGG）可避免这一影响，因为二者识别序列虽然相同，但切点不同。 受此甲基化酶影响的酶还有 Acc65Ⅰ、 AlwNⅠ、 ApaⅠ、EcoRⅡ 和 EaeⅠ 等。
除此之外，还有EcoKⅠ 甲基化酶、SssⅠ 甲基化酶等，但含这种酶的感受态细胞不常见。
你可以看你所要转的感受态细胞的基因，查一查有没有这类甲基化酶，有的话，设计时要尽量避免。或者直接使用不含甲基化酶的感受态，比如JM110或 SCS110。
当然，不同的限制酶对甲基化位点敏感性不同，你可以查看下酶的说明书，有写的。

只要符合以上原则，保护性碱基可以随机加上几个，一般是加4-6个应该就可以了。