Question

高中生物 基因工程相关的疑惑

标记基因是本身在质粒上就有吗？还是和目的基因连在一起导入？
抗原-抗体检测之前为什么要用DNA分子杂交？

Answer 1

这个应该这么理解：
最正规的做法是：目的基因是否成功导入运载体（这里指质粒），会在将重组质粒导入表达宿主之前，先导入克隆宿主，然后从大量繁殖的克隆宿主中提取重组质粒，将提取出的重组质粒进行限制性内切酶酶切，再进行电泳，观察电泳结果中是否存在切下来的目的基因片段，以此来判断目的基因是否成功导入运载体。如果电泳结果正确，我们才会把从克隆宿主中提取的重组质粒导入表达载体。
一般来说标记基因是质粒本来就有的，比如说一些标签基因（His标签或荧光蛋白标签），我们插入目的基因的时候会把目的基因插在启动子的下游，标签基因的上游，这样就会使得外源目的基因和标签基因融合表达（一起表达，注意插入的目的基因3'端不能有终止密码子，当然5‘端和中间也不能有），如果你插入的外源目的基因中存在终止密码子，那么其下游的标记基因就不会表达，说明我们插入的目的基因可能只表达了一段就终止了；如果你插入的目的基因的核酸数不是3的倍数，那么会导致下游标签基因产生移码（阅读框移位），将来标签基因就表达了和预期不一样的肽链，也就无法检测到预期标签基因的功能了。如此反着想你就可以知道标签基因的功能了。
DNA分子杂交可以在目的基因蛋白表达之前就进行检测，也就是说可以更早的从基因水平判断是否达到目的，在一些大量的实验工作中往往可以得到初步的检测确认。但是我们的最终目的是得到蛋白的表达，即时基因水平检测正确，也会有蛋白不表达的其他因素，所以最后以抗原-抗体检测为最可靠的依据。

追问

谢谢你耐心的回答。我还有2个疑惑就是：1.检测目的基因转录的RNA表达了可以不用抗原-抗体检测吗？ 2.“即使基因水平检测正确，也会有蛋白不表达的其他因素。”能举个例子吗？

追答

1. 如果不做抗原抗体检测，只有应该有目的基因表达的目的蛋白做个SDS-PAGE，说明表达了预期大小相符的蛋白（这是最基本的，但是光大小一样也不能说明就是你要的蛋白）；最直接的方法就是纯化你表达的目的蛋白进行其蛋白功能活性检测（设计实验加入你纯化后的蛋白，看是否有你要的目的蛋白的功能，但前提是你要表达的蛋白有直观的功能）
2. 最直观的例子，你连进去你的目的基因了也将载体转入宿主了，但是你连进去的目的基因没有和载体上的读码框一致也就是说移码了，那么DNA分子杂交可以检测到你的目的基因，但是这个转进去的载体表达的不是你的目的蛋白，而是另一个完全不一样的蛋白；还有，如果你用宿主无法识别你转进去的表达载体的启动子，一样不能表达，所以使用的表达宿主和表达载体一定要配套。

Answer 2

标记基因一般是质粒上就有的
DNA分子杂交是为了判断DNA是否已经导入到质粒上

追问

那么既然有DNA分子杂交，为什么还要抗原-抗体检测？
“标记基因的作用在于便于检测目的基因的情况。因为标记基因和目的基因同位于运载体上，要导入都导入，要表达则都会表达。”百度百科上这样说。如果标记基因在质粒上，那这句话不就错了。可能目的基因没有成功导入运载体啊 。

Answer 3

标记基因应该和目的基因连在一起倒入，如果本身质粒有标记基因则无法筛选了。
检测目的基因是否整合到受体细胞的染色体DNA上。

Answer 4

标记基因是人为加上去的,天然的质粒上没有.基因工程用的质粒都是人工改造的,带有标记基因.有公司专门做这个,提供人工改造好的质粒.做实验时只需导入目的基因.给分吧