Question

)下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点，

图l中Cmlr表示氯霉素抗性基因，Ne r 表示新霉素抗性基因。请回答下列问题
(3)可选用________(两种)限制酶同时酶切质粒与外源DNA，酶切并连接后可获得__________种含目的基因的重组质粒，筛选含有该重组质粒的大肠杆菌时，需要在含__________的培养基上培养。
(4)研究发现当CCGG序列在X酶作用下，其内部胞嘧啶残基发生变化后，MspⅠ仍能识别并切割，但HpaⅡ则不能识别，而BamHⅠ和SmaⅠ对类似变化也十分敏感，KpnⅠ则不敏感。若在含有图1所示质粒和X酶的缓冲液中，同时加入KpnⅠ、HpaⅡ、MspⅠ和SmaⅠ并完全酶切后，则最可能得到_____种DNA序列。

疑问，为什么获得2种含目的基因的重组质粒？为什么得到4种DNA序列？

Answer 1

如果只使用单酶切的话，可选择的酶有SmaI酶，酶切后任何酶切产物连到质粒中均有可能是正向和反向2种情况，因此会有2种重组质粒。因为将氯霉素抗性基因切断了，所以需要新霉素抗性培养基筛选。使用kpnI和smaI双酶切连接后只有1种重组质粒了，有新霉素抗性。
x酶处理后可以酶切的有kpnI，MspI，质粒中有1个kpnI位点，2个MspI位点，1个SmaI位点，而smaI位点可以被MspI切开，所以共有4个酶切位点，得到4个片段。