Question

碱裂解法提取的质粒DNA琼脂糖凝胶电泳应该是什么样的?

Answer 1

一般都有3条带。据推测跑在最前边的是cccDNA（共价闭合环），中间的是OC（开环），最后的有点拖带，稍宽，早期多认为是线状的，但后来专家认为断链质粒发生几率很低，形不成条带，因此现在一般认为是处于复制过程中的1.5倍左右的条带。
以上均为推测，每人真的去证明。
但若将质粒提取液单酶切，将会得到整齐的一条带。我实验室经常用这种方法估计质粒的纯度。

追问

老师留了一个思考题：测定实验所提取的质粒DNA的紫外吸收值确定的含量，这个值比实际DNA含量的值偏大还是偏小，why？

追答

偏小。
核酸在波长 260 nm处有最高吸收峰，之所以能吸收紫外光，是由嘌呤环和嘧啶环的共轭双键所决定的。依据紫外吸收值大小估计DNA含量是 假定核酸分子比较小（数十个bp长度），所以碱基都能吸收紫外光，此时吸光度跟核酸长度（含量）成正比，是一个大概估计值，并不精确。定义1OD 的吸光值相当于50μg / ml 的（短链）dsDNA。
质粒由于具有长螺旋结构，使得碱基难以完全暴露在外，导致吸光度相对降低；此外质粒分子大小也远远大于一般 合成的线性DNA分子，也会导致吸光度相对降低。所以，采用UV测定所得的质粒浓度（ug/ml）比实际的浓度偏低。

追问

十分感谢。谢谢你。
再问个问题：芽孢杆菌，OD600=1 与OD600=2浓度是2倍关系，那所含菌数是什么关系。好像不是2倍关系了。 还有怎么确定一定的OD 值所含的菌数。

追答

理论上 OD和菌数呈正相关。但OD测定中的直接测定数值应介于0.2-0.8之间。所谓的OD=2 应该是换算值。如果你测定的直接数据大于1，那么，所测定的OD偏小，直接测定的OD越大，距离真实值越远。

Answer 2

一般都有3条带.据推测跑在最前边的是cccDNA（共价闭合环）,中间的是OC（开环）,最后的有点拖带,稍宽,早期多认为是线状的,但后来专家认为断链质粒发生几率很低,形不成条带,因此现在一般认为是处于复制过程中的1.5倍左右的条带.（仅供参考）

Answer 3

提的好的话会是一条单一的条带，是超螺旋结构。有时会是两条带或三条带，就要看提的质量了。

追问

2,3 条是什么情况呢？

追答

通常情况下碱裂解提取的质粒有三种构象,超螺旋,开环,线性,2条的应该是超螺旋和开环.

追问

谢谢你