Question

求教最近一段时间做的连接转化的平板长斑，而且看上去也正常，但是就是检测不到（菌落PCR和酶切都尝试过）

求教大神，最近一段时间，实验室做的连接转化的平板长斑，而且看上去也正常，但是就是检测不到（菌落PCR和酶切都尝试过），举个例子：比如PE28a这个载体一般很好做的，可是最近几天用通用载体引物就是检测表不到，甚至连空载体都检测不到。可是用原来自己酶切过的PET28a就很容易做出来，所以我怀疑是我们用的试剂什么的污染了，可是查不出来什么原因，请有经验的大侠告知谢谢。效果明显的我会追加悬赏。

Answer 1

这是pet28a有问题了吧，原来切的做好用，现在不好用，肯定载体出问题了。跟别的实验室要点重新扩繁试试

追问

呵呵，不是的， 载体已经测序过的，是正确的，我想很可能是在载体回收的时候出现问题了。谢谢

Answer 2

什么叫连空载体都检测不到？质粒提不出来？pcr验证载体也没有？

我觉着是不是载体没切开呀……你用的是什么酶切位点？

追问

应该不是没有切开，没有切开就是质粒载体了，相当于转化质粒，请问，这个用通用的载体引物还检测不出来么

追答

……没有质粒载体，你怎么提的质粒，怎么做的酶切验证……= =|||
你的通用载体引物是扩增的多克隆位点附近的条带，还是什么？是用扩增出来的片段大小来判断是否插进去的吗？是的话，跑出来的胶图是怎样的呢？引物二聚体有没有？

最傻的办法是多挑几个斑，换个公司的PCR MIX，再检测一下，记得用菌液pcr。

追问

呵呵，我们小抽的质粒还是可以的，而且测序也很好，但是就是酶切过后点胶回收的回来之后再连接的时候出问题了，我怀疑是在回收产物的时候用的Solution出了问题，很有可能是污染了，之后我们换了新的试剂，做出来的效果相对于这几天做的要好很多。另外我们做的就是菌落PCR，甚至把那些没有检测到的克隆都拿去测序了，出的结果什么都不是。

Answer 3

你的通用引物是不是标记错了？比如说两个上游，两个下游。但是你标成了一对？如果说你的目的片段进去了但是检测不到的话你可以送出去测序，然后对序列进行分析！要是目的片段却是进去了则是你的PCR扩增体系出了问题！

追问

通用引物不会搞错的， 我们是自己设计合成的，

追答

我的意思是你有没有拿错~拿了俩上游或者是俩下游